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发稿时间：2019-03-28来源：天昊生物

在我们年初的一篇分享中《潜在热点？——dna 6ma甲基化修饰》，我们总结了human样本中涉及dna n6甲基腺嘌呤修饰（6ma）的6篇文章。本期我们针对文章中有关6ma修饰常用的检测方法和调控的基因/酶做了简单的梳理，另外近期该领域又发表了一些新的paper。

方法

从2019年3月最新的一篇nature综述中总结的利用现代测序技术解码细菌表观基因组能够看出，单碱基分辨率条件下用于6ma检测的方法有限制酶消化后测序、单分子实时测序、纳米孔测序。其中三代测序smrt和nanopore能够直接检测dna甲基化修饰，无需pcr扩增的步骤[1]。之前解读的human样本一篇文献就有利用到smrt的方法（下图1）[2]。

图1 smrt用于6ma检测

从2015年的nature（图2）和cell（图3）综述中可以看出更加常用的方法包括基于免疫沉淀（ip）和质谱（lc-ms/ms）的检测[3, 4]，尤其是基于ip的方法。

图2 nature综述中6ma检测方法总结

图3 cell综述中6ma检测方法总结

基于6ma-ip-seq方法检测6ma相关的research文章包括human样本中涉及恶性胶质瘤6ma修饰[5]、人类基因组6ma修饰图谱等[6]（图4）。测序后可以利用6ma-ip-qpcr对目的基因进行验证分析。

图4 6ma-ip-seq策略研究6ma修饰

通常这些文章中经常还会设计dot blot（图5a）和质谱实验（图5b）检测6ma修饰总体水平以及6ma/a比例。基于6ma-ip也可以用于6ma总体水平定量。这些研究策略类似于m6a rna甲基化常用的方法！

图5 dot blot和ms用于6ma总体水平定量

另外还有些文章开发新的方法或者对ip策略进行改进利用在6ma检测中，包括免疫荧光用于6ma可视化检测等[5, 7, 8]。

修饰酶

从最新的2019年3月份nature有关dna修饰的综述中总结中可以发现不同物种中6ma修饰和去修饰相关的酶（图6）[9]。

图6 dna修饰及相关修饰酶

其中在human样本中关注度比较高的为6ma去甲基化酶alkbh1，如先前解读的human样本cell [5]、molecular cell [6]、bone research [10]文章，molecular cell也研究了n6amt1这一甲基化转移酶的作用。而nar上突破性文章曾报道ssbp1作为6ma结合蛋白在线粒体dna修饰和复制中的作用，同时也发现alkbh1作为一种线粒体蛋白与6ma去甲基化酶相关[11]。目前来看在人类样本中经验证的修饰酶的种类比较有限，期待后续更多的新发现。

数据库

最后介绍一个数据库methsmrt，smrt测序整合的6ma和4mc数据，由中山大学开发，但是目前收录的物种没有人，网址链接http://sysbio.sysu.edu.cn/methsmrt/[12]。

图7 methsmrt数据库收录物种

1. beaulaurier, j., e.e. schadt, and g. fang, deciphering bacterial epigenomes using modern sequencing technologies. nat rev genet, 2019. 20(3): p. 157-172.

2. zhu, s., et al., mapping and characterizing n6-methyladenine in eukaryotic genomes using single-molecule real-time sequencing. genome res, 2018. 28(7): p. 1067-1078.

3. luo, g.z., et al., dna n(6)-methyladenine: a new epigenetic mark in eukaryotes? nat rev mol cell biol, 2015. 16(12): p. 705-10.

4. heyn, h. and m. esteller, an adenine code for dna: a second life for n6-methyladenine. cell, 2015. 161(4): p. 710-3.

5. xie, q., et al., n(6)-methyladenine dna modification in glioblastoma. cell, 2018. 175(5): p. 1228-1243 e20.

6. xiao, c.l., et al., n(6)-methyladenine dna modification in the human genome. mol cell, 2018. 71(2): p. 306-318 e7.

7. liu, b., et al., metabolically generated stable isotope-labeled deoxynucleoside code for tracing dna n(6)-methyladenine in human cells. anal chem, 2017. 89(11): p. 6202-6209.

8. liu, x., et al., predominance of n(6)-methyladenine-specific dna fragments enriched by multiple immunoprecipitation. anal chem, 2018. 90(9): p. 5546-5551.

9. deniz, o., j.m. frost, and m.r. branco, regulation of transposable elements by dna modifications. nat rev genet, 2019.

10. zhou, c., et al., dna n(6)-methyladenine demethylase alkbh1 enhances osteogenic differentiation of human mscs. bone res, 2016. 4: p. 16033.

11. koh, c.w.q., et al., single-nucleotide-resolution sequencing of human n6-methyldeoxyadenosine reveals strand-asymmetric clusters associated with ssbp1 on the mitochondrial genome. nucleic acids res, 2018. 46(22): p. 11659-11670.

12. ye, p., et al., methsmrt: an integrative database for dna n6-methyladenine and n4-methylcytosine generated by single-molecular real-time sequencing. nucleic acids res, 2017. 45(d1): p. d85-d89.