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发稿时间：2020-09-03来源：天昊生物

近日，浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科郑树森院士团队在molecular cancer杂志（if=15.302）发表最新研究成果：去甲基化酶alkbh5通过m6a修饰表观上抑制下游靶点lypd1从而限制了肝细胞癌的恶性。这一发现突出了m6a去甲基化酶的重要价值，丰富了对m6a表观修饰在癌症研究中的理解，进一步为开发有效的预测因子和hcc治疗策略提供了新的见解。其中，陈云浩博士作为论文的第一作者，郑树森院士和吴健教授作为论文的共同通讯作者(https://doi.org/10.1186/s12943-020-01239-w)。天昊生物有幸参与了论文的甲基化rna免疫沉淀测序（merip-seq）和数据分析工作。

m6a修饰作为一种新兴的表观遗传调控，广泛参与肝细胞癌(hcc)的肿瘤发生过程，为研究该疾病的分子发病机制提供了新的视角。多个m6a甲基化酶或去甲基化酶在hcc中已经有相关报道参与肿瘤进展，如mettl3、mettl14、wtap、kiaa1429、fto。然而m6a去甲基化酶之一alkb同源物5 (alkbh5)在hcc中的作用尚未得到充分证实。因此，课题组在这项研究力图阐明alkbh5在hcc中的生物学特性和潜在机制。现将主要研究结果呈现给大家：

一、alkbh5的表达下调与hcc患者不良预后相关

为了研究alkbh5在hcc中的表达，作者首先分析了alkbh5在hcc及相应癌旁组织中的mrna和蛋白水平，发现alkbh5在hcc中显著下调(图1a-c)。随后，来自一个独立hcc队列的免疫组化证实了这些结果(图1d, e)。此外，较低alkbh5表达的hcc患者其总生存期(os)和无复发生存期(rfs)更短(图1f)。另外，alkbh5的缺失可以作为hcc患者的独立预后因素(hr = 2.24, p = 0.007)(图1g)。这些结果提示alkbh5的失调可能参与了hcc的进展。

二、alkbh5在体外和体内抑制hcc增殖

为了评估alkbh5在hcc中的生物学功能，首先在细胞系中利用cck-8和菌落形成实验发现敲低alkbh5可增强hcc细胞的增殖能力，而上调alkbh5则表现出相反的效果(图2a)。同样，体外edu检测也显示alkbh5可以抑制细胞生长(图2b-e)。其次，在小鼠模型中发现当alkbh5沉默时，与对照组相比，移植瘤体积和重量均增加(图2f)。相反，过表达alkbh5会限制肿瘤生长，显著降低肿瘤体积和重量(图2g)。这些结果表明alkbh5在体内外均能抑制hcc肿瘤生长。

三、alkbh5抑制hcc细胞的迁移/侵袭能力，并抑制体内转移

研究人员利用transwell实验发现抑制alkbh5促进了hcc细胞的迁移和侵袭能力，而过表达alkbh5则影响了这些表型(图3a)。伤口愈合实验也显示，alkbh5有减弱hcc细胞迁移的趋势(图3b)。有趣的是，当alkbh5沉默时，研究人员总能在显微镜下观察到细胞形态的改变。为了验证这种现象是否由细胞骨架重塑引起，随后进行了鬼笔环肽(phalloidin)染色。正如预期的一样，通过微管和微丝的重排，alkbh5的敲低导致细胞骨架更加松散和分散(图3c, d)，这表明一种更加活跃的迁移形式。为了阐明alkbh5在体内对hcc转移的影响，将alkbh5过表达和阴性对照hcclm3-luc细胞经尾静脉注射植入balb/c小鼠体内，并进行生物发光成像。结果发现激活alkbh5可以降低hcc细胞的转移潜能，具有更低的荧光素酶活性及更少的肺转移灶(图3e, f)， he染色结果也证实了这一点(图3g)。相反，沉默alkbh5则促进了hcc的转移。因此，alkbh5在体外抑制了hcc细胞的迁移/侵袭能力，在体内抑制了转移能力。

四、merip-seq结合rna-seq结果显示lypd1是alkbh5的靶点

作者首先应用dot blot检测了alkbh5对m6a修饰的调节作用。alkbh5的缺失导致huh7和mhcc97h细胞中m6a水平明显升高，而过表达alkbh5则产生相反的结果(图4a)。为了发现观察到的依赖alkbh5表型的确切机制，作者利用稳定的alkbh5过表达和载体转染的hcclm3细胞（每组两个生物学重复），采用merip-seq和rna-seq相结合的方法（天昊生物参与部分实验和分析工作）。merip-seq显示，当alkbh5上调时，有1538个差异的m6a peaks丰度降低(1344个相应的转录本)。同时，rna-seq发现了481个在alkbh5过表达时下调的转录本。作者更重视甲基化模式和表达水平受alkbh5调控的癌基因。因此只选择那些在alkbh5过表达时同时具有低的m6a peaks和表达降低的转录本进行后续研究(图4b)。为了进一步缩小候选基因的范围，集中在重叠的前10个基因，即coch、lypd1、adamts14、abca4、tp53i11、colca2、tmed7、cyp4f3、il17rb和vcan。在alkbh5沉默或过表达的细胞中通过qpcr进行初步验证(图4c)。有趣的是，在所有三种肝癌细胞中，只有lypd1始终被alkbh5负向调控(图4d-g)，western blot结果进一步证实了这一点(图4h)。综上所述，lypd1可能是alkbh5的直接下游靶点。

五、alkbh5依赖于igf2bp1介导m6a修饰破坏了lypd1的稳定性

merip-seq分析显示，随着alkbh5的过表达，lypd1的3’utr区m6a peak显著缩小(图5a)。为了证实这一结果，首先在huh7和hcclm3细胞中使用anti-alkbh5抗体进行rip实验。结果观察到，alkbh5可以富集lypd1 mrna(图5b)，这意味着lypd1可能在与alkbh5相互作用后在rna水平上受到调控。然后，利用针对潜在m6a位点的设计特异性引物进行merip-qpcr检测，结果显示，敲低alkbh5可促进lypd1 3’utr区修饰，而激活alkbh5可导致该位点m6a水平下降(图5c)。为了进一步证明m6a在调控lypd1中的重要作用，研究人员设计了一个荧光素酶报告基因，插入一个野生型(wt) lypd1 3’utr序列或突变体(mut)，其对应的m6a位点发生了突变(图5d)。与预期的一样，当alkbh5沉默时，转染lypd1-wt质粒的细胞荧光素酶活性呈上升趋势，而突变组的荧光素酶活性似乎未受影响。类似的结果也可以在alkbh5过表达的细胞中得到验证(图5e)。此外，研究发现alkbh5缺乏导致lypd1 mrna降解速度减慢，而alkbh5过表达则破坏了lypd1的稳定性(图5f)。

已经明确了阅读器(readers)对m6a修饰的转录本的直接影响至关重要，作者进一步研究了参与上述过程的潜在效应物。结果发现ythdf1/2和igf2bp2/3的干预对lypd1的表达几乎没有影响。然而，当igf2bp1受损时，lypd1明显受到抑制(图5g)，这与igf2bp1促进其靶点转录的认识是一致的。rip实验证实了igf2bp1蛋白与lypd1 mrna的相互作用(图5h)。此外，igf2bp1敲低抑制了alkbh5缺失引起的lypd1积累(图5i)。综上所述，lypd1受alkbh5介导的m6a修饰调控，并被igf2bp1识别从而增强了其稳定性。

六、lypd1被确认为hcc的致癌驱动基因

为了阐明lypd1在hcc中的作用，研究人员建立了lypd1敲低的huh7和mhcc97h细胞系(图6a, b)。cck-8和菌落形成试验表明，沉默lypd1抑制细胞生长和生存能力(图6a, b)，这一结果与edu结果一致(图6c, d)。此外，lypd1缺失导致hcc细胞迁移和入侵能力的抑制(图6e, f)。为了评估lypd1在体内的作用，慢病毒携带shrna靶向lypd1转染到huh7和mhcc97h细胞，随后在裸鼠身上进行了皮下植入实验。正如预期的那样，lypd1基因敲低显著影响了移植瘤的生长(图6g, h)。

此外，作者进行了生物信息学分析以探讨lypd1的临床相关性。tcga的hcc队列和geo数据集的其他三个队列的分析表明，与正常组织相比，肿瘤组织中lypd1表达上调(图6i)此外，kaplan-meier分析提示在hcc中lypd1高表达与较差的os和dfs相关(图6j)。综上所述，lypd1在hcc发展过程中被激活，并促进了hcc的肿瘤发生。

七、alkbh5的抑制作用被lypd1的缺失所逆转

为了证实观察到的表型是由alkbh5-lypd1信号轴的失调介导的，研究人员进行了多次功能拯救实验。cck-8和菌落分析显示，alkbh5的表达降低导致两种hcc细胞的增殖能力增强，而这种能力可以通过沉默lypd1逆转(图7a-d)。lypd1的敲低也显著地消除了alkbh5缺失所导致的迁移能力增加(图7e-g)。此外，伤口愈合实验表明，抑制alkbh5不能促进lypd1沉默的huh7和mhcc97h细胞的迁移(图7h)。综上所述，lypd1功能障碍可能与alkbh5介导的hcc细胞增殖或迁移特征有关。

八、alkbh5/lypd1轴在hcc中的临床意义

为了进一步探讨hcc组织中alkbh5和lypd1表达的相关性，科研人员在第二个队列的对这两个蛋白进行了ihc染色。正如所料，大约有62.2%的标本的表达较低的alkbh5但是呈现出强lypd1染色，而近66.7%的alkbh5高表达样本表现出较弱的lypd1染色(图8a, b)。此外，两个独立的geo数据的分析显示，alkbh5与lypd1在rna水平上呈现负相关(图8c)。综上所述，在hcc样本中，alkbh5和lypd1的表达呈负相关。

天昊生物具有多年基因组、转录组和表观组等多组学检测与分析的经验，m6a rna甲基化作为表观领域的一大热点，天昊生物自主设计了m6a调控因子（writers/erasers/readers）差异表达分析检测panel，还可以提供m6a修饰整体水平定量检测，并结合merip-seq和rna-seq挖掘受m6a调控因子影响的下游靶点，同时可对相关的靶点进行merip-qpcr验证。生信团队亦可提供个性化的m6a数据库挖掘与生信分析内容。

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