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发稿时间：2020-05-21来源：天昊生物

 

南京农业大学动物生理生化重点实验室和扬州大学动物科技学院近期在家禽学杂志《poultry science》上发表论文，发现母体甜菜碱的补充可以调节srebp2和cyp7a1基因启动子dna甲基化水平，进而降低鸡后代的肝胆固醇沉积。本研究采用了methyltarget^®多重目的区域甲基化富集测序技术，在恭喜客户文章发表的同时，我们也跟大家一起分享下本文的研究思路。英文题目：maternal betaine supplementation decreases hepatic cholesterol deposition in chicken offspring with epigenetic modulation of srebp2 and cyp7a1 genes中文题目：母体甜菜碱的补充调控srebp2和cyp7a1基因表观遗传来降低鸡后代肝胆固醇的沉积期刊名：poultry science影响因子：2.027发表时间：2020-4-14

研究摘要

有研究表明，哺乳动物母体中的甜菜碱可以调控后代的肝胆固醇代谢，然而给蛋鸡喂食甜菜碱如何影响后代鸡的肝脏胆固醇代谢尚不清楚。本研究给如皋黄羽蛋鸡(n = 120)饲喂基础日粮或添加0.5%甜菜碱的日粮28天，然后收集鸡蛋进行孵化。结果显示，母鸡中的甜菜碱显著降低子代鸡肝脏胆固醇含量。胆固醇生物合成酶、甾醇调节因子结合蛋白2 (srebp2)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶降低，而将胆固醇转化为胆汁酸的胆固醇-7α-羟化酶(cyp7a1)在甜菜碱处理的子代鸡中的mrna和蛋白质水平均增加。甜菜碱处理组肝脏低密度脂蛋白受体的mrna和蛋白表达显著增加，而介导胆固醇酯化的胆固醇酰基转移酶1的mrna丰度显著降低。同时，dna甲基转移酶1和甜菜碱同型半胱氨酸甲基转移酶的蛋白含量增加，这与受影响胆固醇代谢基因cpg甲基化的改变有关。此外，甾醇调节因子结合蛋白2的基因启动子上的cpg甲基化水平增加，而胆固醇酰基转移酶1的丰度降低。这些结果表明，对母鸡甜菜碱的补充可以通过对后代幼鸡胆固醇代谢基因的表观遗传调节，显著降低肝脏胆固醇沉积。

 

研究背景

胆固醇对细胞活力和功能至关重要，肝脏是胆固醇代谢的主要场所，而胆固醇及其代谢产物水平与鸡脂肪肝综合征疾病有关，严重影响蛋鸡的健康和生产效率，给养禽业造成巨大的经济损失。因此，控制肝脏胆固醇代谢将有益于鸡的健康和相关产业的预防策略。

肝脏中胆固醇代谢的体内平衡取决于胆固醇生物合成和转化的动态平衡。srebp2是激活胆固醇生物合成基因的关键转录因子，如3-羟基-3-甲基戊二酰-coa还原酶(hmgcr)。胆固醇可以通过cyp7a1转化为可排泄的胆汁酸而被分解。许多研究表明，srebp2和cyp7a1是调节后代胆固醇代谢的关键因素，以应对母体营养干预。在鸡中，探索蛋鸡后代中的srebp2和cyp7a1表达是否易受母体营养状态的影响是很有意义的。

甜菜碱是甘氨酸的三甲基衍生物，可直接从饮食中获得，或通过氧化从饮食胆碱中间接获得。甜菜碱可以通过一个碳代谢激活dna甲基化，从而调节胆固醇代谢基因的转录。最近的研究提供了证据，表明母体甜菜碱暴露增加了肝胆固醇的积累以及cyp7a1基因启动子的高甲基化。值得注意的是，母鸡日粮中添加甜菜碱会引发后代鸡srebp2和hmgcr基因启动子的低甲基化，导致下丘脑胆固醇含量升高。本文研究者以前曾报道过，卵内注射甜菜碱可通过表观遗传基因调节来减轻幼年鸡体内皮质酮诱导的肝胆固醇沉积。然而，当母鸡饲喂甜菜碱时，表观遗传修饰是否参与了后代鸡肝脏胆固醇代谢基因转录物的调节仍不清楚。

因此，本研究的目的是调查母鸡日粮中添加甜菜碱是否能调节子代幼鸡的肝脏胆固醇代谢，以及这种影响如何与srebp2和cyp7a1基因启动子上的dna甲基化相关。

 

材料和方法

将38周龄的120只如皋黄羽母鸡随机分为对照组和甜菜碱组，每组包含60只母鸡，在20个笼子里(每个笼子3只母鸡)，饲喂基础日粮(对照)或添加0.5%甜菜碱的日粮(甜菜碱组)，为期4周。记录初始体重和产蛋能力。在饮食处理后的第18天和第24天对鸡进行人工授精。从每组收集200个在饮食处理的最后4天(第25-28天)产下的鸡蛋。小鸡在保育箱中孵化，一日龄的小鸡被单独称重。所有的小鸡都喂食相同的食物。从孵化到56日龄，每周记录生长表现。在57日龄时，从每组中选择30只雄性鸡(每组15只)，称重后处死，采集血样，分离血浆，并在-20℃下储存。肝脏(无胆囊)样品在液氮中快速冷冻，并保持在-80℃下待进一步分析。

之后进行的实验包括肝脏和血浆的胆固醇含量测定，以及rt-pcr、wb、medip实验，并采用天昊methyltarget^®多重目的区域甲基化富集测序技术，对目的基因启动子的cpg甲基化进行了亚硫酸氢盐测序分析。

 

研究结果

体重、肝脏重量、血清胆固醇和hdl-c浓度、肝脏胆固醇含量母体甜菜碱对后代鸡的体重(图1a)和肝脏重量(图1b)没有显著影响。然而，添加甜菜碱的鸡的后代在血浆(图1c)和肝脏(图1f)中的胆固醇浓度显著降低。此外，与对照组相比，补充母体甜菜碱显著降低了血浆中hdl-c含量(图1d)。血浆中的ldl-c浓度没有明显变化 (图1e)。

 

图1、补充母体甜菜碱对仔鸡体重、肝脏重量、血浆胆固醇浓度和肝脏总胆固醇含量的影响。

 

胆固醇代谢相关基因在肝脏中的表达在甜菜碱处理的鸡的后代中，甜菜碱引起肝脏胆固醇生物合成基因srebp2、hmgcr和胆固醇分解代谢基因cyp7a1及acat1和ldlr在mrna(图2a)和蛋白质(图2b)水平的显著表达，其他胆固醇代谢基因在基因水平未检测到显著变化。

图2、甜菜碱对幼鸡肝脏胆固醇代谢基因表达的影响。

 

蛋氨酸循环和甲基转移基因的肝蛋白含量在蛋氨酸循环中涉及的4种酶中，甜菜碱的补充显著增加甜菜碱同型半胱氨酸甲基转移酶(bhmt)和腺苷同型半胱氨酸酶样1 (ahcyl1)的肝蛋白含量(图3a)。此外，甜菜碱处理的后代鸡的肝脏中的dna甲基转移酶1 (dnmt1)的蛋白质含量显著增加(图3b)。甜菜碱处理鸡的后代中，蛋氨酸腺苷转移酶2b (mat2b)、甘氨酸n-甲基转移酶(gnmt)和脱氧核糖核酸甲基转移酶3a (dnmt3a)的肝蛋白含量无显著变化。

图3、补充母体甜菜碱对碳代谢甲基转移相关酶类肝蛋白含量的影响。

 

肝脏中srebp2、cyp7a1和acat1基因启动子的cpg甲基化对从肝脏分离的基因组dna的methyltarget^®多重目的区域甲基化富集测序分析显示，srebp2、cyp7a1和acat1基因启动子区的cpg甲基化状态受母体甜菜碱喂养的调节。对于srebp2基因启动子，分析了cpg岛的两个区域(图4a)。片段1跨越翻译起始密码子atg上游-2030到-1612，包含13个cpg位点，而片段2跨越-3384到-2987，包含12个cpg位点。与对照组相比，甜菜碱组片段1上的7个cpg位点显著高甲基化，片段2上的9个cpg位点显著高甲基化，而片段2上的2个cpg位点为低甲基化 (图4b、4c)。同时，medip结果证实，在甜菜碱处理的鸡的后代中，srebp2启动子显著高甲基化(图4d)。

图4、肝脏中srebp2基因启动子的甲基化状态。

 

对cyp7a1基因启动子分析了1个片段(图5a)。该片段位于翻译起始密码子atg的上游-282到-53，包含7个cpg位点。在甜菜碱组中，在cyp7a1基因启动子上检测到的7个cpg位点中有6个是低甲基化(图5b)。medip结果显示，在甜菜碱处理的鸡的后代中，cyp7a1启动子显著地低甲基化 (图5c)。

图5、肝脏中cyp7a1基因启动子的甲基化状态。

 

对acat1基因启动子分析了1个片段(图6a)。该片段位于翻译起始密码子atg的上游-483到-269，包含19个cpg位点。在acat1基因启动子上检测到的19个cpg位点中有7个是高甲基化，在甜菜碱组中19个cpg位点中有1个是低甲基化的(图6b)。medip结果显示，在甜菜碱组中，acat1基因启动子显著高甲基化(图4c)。

图6、肝脏中acat1基因启动子的甲基化状态。

 

总的来说，在所有检测到的片段中，srebp2、cyp7a1和acat1基因启动子的平均甲基化率分别与它们的mrna丰度成反比。

 

研究结论

本研究证明了母体甜菜碱的补充可以改变对胆固醇代谢基因的表观遗传，进而降低子代幼鸡肝脏中的胆固醇含量。

昊技术

天昊methyltarget^®多重目的区域甲基化富集测序技术：

§  性价比高：传统克隆测序一个片段10个克隆的价格，methyltarget可以完成约60个片段的检测（检测深度为1000x，相当于1000个克隆）。

§  精确度高：基于二代测序数据检测甲基化程度，精确到单碱基分辨率，与基于测序的全基因组甲基化测序，rrbs数据有高度一致性。

§  精确定量：测序深度高达1000x，并可以进一步加深，相比于传统克隆测序，可以对位点甲基化程度进行准确定量。

§  技术灵活：基于多重pcr富集进行目标区域富集，可随时进行基因和位点的变化和改动，并且可以获得每个片段的甲基化单倍型。

 

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