中国农业科学院蜜蜂研究所吴黎明研究员课题组的研究成果近期发表在环境科学与生态学top期刊《environmental pollution》上，研究成果发现烯啶虫胺干扰肠道微生物群，影响代谢稳态和蜜蜂的免疫力，文章第一作者为该课题组博士后朱丽珍。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的相对定量扩增子测序工作。在恭喜客户发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。
英文题目：nitenpyram disturbs gut microbiota and influences metabolic homeostasis and immunity in honey bee (apis mellifera l.)
中文题目：烯啶虫胺干扰蜜蜂肠道微生物群，影响代谢稳态和免疫
期刊名：environmental pollution
影响因子： 5.714
研究概要：
近年来，新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的环境风险和毒性引起了人们的广泛关注。然而，新烟碱类杀虫剂对肠道微生物的影响相关研究还很有限。在本研究中，将意大利蜜蜂工蜂暴露于亚致死剂量的烯啶虫胺14天。结果表明，烯啶虫胺暴露降低了蜜蜂的存活率和摄食量。此外，16s扩增子测序显示，烯啶虫胺引起了几种关键肠道微生物群相对丰度的显著变化，这几种肠道微生物菌属在代谢、免疫等方面发挥重要作用。使用rna-seq转录组测序分析，鉴定到526个差异表达基因(degs)，其中包括代谢、解毒和免疫等过程的功能基因。此外， go和kegg的pathway分析表明，烯啶虫胺影响了几种生物过程，其中大部分与代谢有关。总之，这些研究表明，由烯啶虫胺引起的蜜蜂肠道微生物群失调可能影响蜜蜂的代谢稳态和免疫功能，进而降低蜜蜂的摄食量和生存率。
研究背景：
蜜蜂是农业上以及世界上的自然生态系统最重要的传粉者，对人类的粮食供应做出了重大贡献。作为采集昆虫，当它们采集花蜜和花粉时，蜜蜂特别容易受到外源毒素的暴露。在已知对蜜蜂有毒的农用化学品中，新烟碱类杀虫剂是世界范围内发展最快的杀虫剂之一。研究表明，新烟碱类杀虫剂对蜜蜂和其它传粉者有一系列的负面影响，包括对工蜂的行为、学习、记忆、免疫能力、定向和觅食等方面的影响，还会降低了蜂王的生殖力。烯啶虫胺是应用最广泛的第二代新烟碱类杀虫剂之一，与其他新烟碱类物质一样，烯啶虫胺也是昆虫烟碱乙酰胆碱受体（nachr）的激动剂，在昆虫中枢神经系统（cns）的快速兴奋性突触传递中起重要作用。然而，由于其广泛的用途和高水溶性的性质，它可以很容易地转移到环境中。先前的一项研究证明，在加拿大萨斯喀彻温省萨斯卡通市30公里范围内的蜂箱中发现的花粉中含有烯啶虫胺。同样，最近的一项研究报告称，在从中国不同地区采集的30份蜂蜜样品中检测到烯啶虫胺残留，其残留量为13-41微克/千克。此外，据报道，烯啶虫胺对非靶标生物有不良影响，研究发现烯啶虫胺对6种非靶标生物有急性毒性，发现烯啶虫胺对蚯蚓有中等毒性，对蜜蜂和家蚕有高毒性，因此应重视烯啶虫胺对环境生物的潜在危害及其毒性效应。
肠道微生物在维持宿主健康方面发挥着重要作用。在蜜蜂体内，肠道微生物群相对简单和保守，具有食品加工、免疫系统调节和病原体防御等功能。因此，研究农药对肠道菌群的影响，将有助于探索农药的作用机理，有利于农药的使用和蜜蜂的保护。目前，新烟碱类杀虫剂暴露对蜜蜂肠道菌群的负面影响的研究有限，只有最近的一项研究发现吡虫啉降低了蜜蜂的存活率，但对肠道菌群没有影响。因此，有必要对新烟碱类杀虫剂进行环境毒理学研究，以反映其对蜜蜂肠道微生物的环境风险。在本研究中，蜜蜂暴露在一系列浓度的烯啶虫胺中14天，以评估存活率、食物消耗量和肠道细菌群落，以及探索对蜜蜂肠道基因谱的影响。总的来说，结果表明，暴露于烯啶虫胺会扰乱蜜蜂的肠道微生物群，进一步影响代谢稳态和免疫，相信该结果可为新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒理学研究提供一些新的信息。
研究方法：
实验设计：
蜜蜂连续喂饲含有3, 30, 300μg/l烯啶虫胺浓度的50%（w/v）蔗糖溶液14天，50%蔗糖溶液作为对照（0微克/升）。每种处理组都有三个重复，每个重复包括30只工蜂。每24小时更新处理液，记录各组死蜂，计算存活率。每天在将注射器中的溶液放入容器之前和从容器中取出之后对其进行称重，这一差额相当于前一天活蜜蜂所消耗的食物总量，计算每只蜜蜂所消耗的食物量。杀虫剂处理后，工蜂的中肠被收集在1.5毫升离心管中，立即冷冻在液氮中，保存在-80度低温冰箱，直到进一步分析。
16s扩增子相对定量测序：
从每个组中，6条中肠汇集成1个生物样本，每组包括3个生物学重复样本（每组n=3），然后进行16s扩增子相对定量测序（v3-v4区域）。
rna-seq测序：
从每个组中，6条中肠汇集成1个生物样本，每组包括3个生物学重复样本（每组n=3），然后进行rna-seq测序。
研究结果：
烯啶虫胺对蜜蜂的急慢性毒性
在急性毒性试验中，蜜蜂在两个时间点（24和48 hpf）的死亡率如图1a所示。结果表明，烯啶虫胺对蜜蜂的致死作用呈浓度依赖性。当烯啶虫胺浓度为3.00 毫克/升及以下时，对照组与烯啶虫胺组24小时死亡率无显著性差异，而浓度为3.00 毫克/升以上时死亡率有显著性差异，当暴露在6.00 毫克/升的烯啶虫胺中，几乎所有的蜜蜂都在48 hpf死亡（图1a）。在慢性毒性试验中，对照组蜜蜂存活率在90%以上，3微克/升和30微克/升浓度组的蜜蜂存活率与对照组无显著差异（图1b）。而300微克/升烯啶虫胺处理组12天和14天的蜜蜂存活率显著低于对照组，分别低至76.6%和73.3%（图1b）。暴露于烯啶虫胺14d后，对蜜蜂的累积摄食量也有明显的影响，如图1c所示，与对照组相比，在浓度为3和30微克/升烯啶虫胺时，累积食物消耗量没有显著差异。（图1c），而暴露于300微克/升烯啶虫胺的蜜蜂的累积食物消耗量显著低于对照组蜜蜂（图1c）。
图1 300μg/l烯啶虫胺对蜜蜂的毒性效应。（a） 在24小时和48小时暴露于烯啶虫胺后成年蜜蜂的急性死亡率。（b）不同浓度烯啶虫胺对蜜蜂存活的影响。（c）不同浓度烯啶虫胺对蜜蜂累积摄食量的影响。
烯啶虫胺对蜜蜂肠道细菌群落的影响
为探讨烯啶虫胺对肠道菌群变化的影响，对对照组和暴露于300微克/升烯啶虫胺14天的蜜蜂的肠道菌群进行了分析（n=3）。通过基于v3-v4区的16s扩增子测序，其中，对照组和300微克/升烯啶虫胺组共同享有68个otus， 8个otus是在对照组特异存在，34个otus是在300微克/升烯啶虫胺组特异存在。如图2a所示，在门水平上，对照组和300微克/升烯啶虫胺组中，proteobacteria, firmicutes 和actinobacteria是最丰富的菌，两组的微生物组成无显著差异（图2a）。在纲水平上，gammaproteobacteria丰度显著降低，从对照组的40.34%降低到300微克/升烯啶虫胺组的11.09%（图2b），烯啶虫胺暴露后，betaproteobacteria, bacilli, alphaproteobacteria的组成增加，betaproteobacteria从26.10%增加到43.05%，bacilli从27.10%增加到31.77%，alphaproteobacteria从6.20%增加到13.17%（图2b）。在属水平， 300微克/升烯啶虫胺组frischella, bartonella, bifidobacterium的丰度均显著增加，而gilliamella的丰度显著减少（图2c）。
根据加权unifrac的pcoa分析，300微克/升烯啶虫胺组的肠道菌群与对照组有偏差（图2d），但adonis分析得出pcoa的p值为0.20，表明两组肠道菌群的差异不显著。top3菌属的聚类分析结果显示，烯啶虫胺组肠道菌群与对照组相比差异显著（图2e）。此外，lefse分析表明，对照组中含有丰富的gammaproteobacteria (class), orbales (order), orbaceae (family), gilliamella (genera) and gilliamella apicola (species)，而在300微克/升烯啶虫胺组中，frischella (genera) , frischella perrara, lactobacillus helsingborgensis (species)含量丰富（图2f）。
图2 烯啶虫胺对蜜蜂肠道菌群组成的影响。（a） 对照组和300mg/l烯啶虫胺组肠道菌群的门水平组成。（b）对照组和300mg/l烯啶虫胺组肠道菌群的纲水平组成。（c） 对照组和300mg/l烯啶虫胺处理组在属水平注释到的序列百分比。（d） unifrac主成分分析法（pcoa）分析对照组和300300mg/l烯啶虫胺处理组的肠道微生物群。（e）对照组和300mg/l烯啶虫胺处理组前30个最丰富属的聚类热图。（f） lefse分析显示不同组别样品中细菌的差异。
原始序列处理与基因定量表达
为研究烯啶虫胺对蜜蜂肠道基因表达的影响，采用rna-seq技术分析了烯啶虫胺（300μg/l）处理14d后与对照组（n=3）相比的蜜蜂肠道差异表达基因（degs）。每个文库测到超过420万个原始序列，超过92.83%的序列能成功地匹配到蜜蜂基因组的唯一或多个位置。如图3a所示，烯啶虫胺组和对照组表达的基因平均数分别为9481和9402；两组中共表达9265个基因（图3a）。暴露于300微克/升烯啶虫胺的蜜蜂共检测到526差异表达基因（degs），其中240（45.6%）被上调，54.4%被下调（图3b）。根据表达模式的相似性，两组之间所有显著差异表达的基因（sdegs）被绘制在热图中（图3c），分层聚类将对照组蜜蜂的所有三个样本聚集在一个集群内，而300微克/升烯啶虫胺处理的蜜蜂形成另一个集群。使用其它聚类方法，如主成分分析（pca），也得到了类似的结果（图3d）。
除了未分类的基因外，我们还分析了表达上调最显著的20个基因和表达下调最显著的20个基因。这些差异基因编码调节多种生物过程的蛋白质或酶。例如，在暴露于300微克/升烯啶虫胺的蜜蜂肠道中，参与代谢的几个基因发生了变化，如pepck（基因id 412843）、faxdc2（基因id 727357）和载脂蛋白（基因id 408961）等。此外，一些与免疫和病原体防御相关的基因也发生了显著的改变，如secapin（基因id 406145）、tlr4（基因id 724187）、endochitinase（基因id 551600）等。此外，300微克/升烯啶虫胺对蜜蜂肠道中几种解毒相关基因的表达也有影响，如cyp6a14（基因id 724946）、e4（基因id 409801）和过氧化物酶（基因id 100577249）。
图3 烯啶虫胺（300μg/l）处理14d后与对照组相比的蜜蜂肠道差异表达基因（degs）。（a）venn图表示烯啶虫胺处理组和对照蜜蜂之间显著差异表达基因（sdegs）的数量。（b） 烯啶虫胺（300μg/l）处理14d后的蜜蜂的差异表达基因的火山图。红点：烯啶虫胺处理蜜蜂的上调基因；绿点：烯啶虫胺处理蜜蜂的下调基因；蓝点：无显著差异。（c）两组之间所有显著差异表达的基因（sdegs）的热图分析。（d） 烯啶虫胺组与对照组差异表达基因的主成分分析（pca）。
go功能和kegg通路分析
根据go分析，462 个degs被分为三类：分子功能、细胞成分和生物过程，其中大多数差异基因归类为分子功能，包括蛋白质异二聚活性、转运体活性、蛋白质二聚活性、血红素结合和四吡咯结合。在kegg数据库中，有84个degs被识别并映射到68个通路。表1列出了9条最重要的富集通路，包括戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、药物代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、甘油磷脂代谢、淀粉和蔗糖代谢、鞘脂代谢、色氨酸代谢和卟啉、叶绿素代谢和视黄醇代谢（表1）。
表1 9条显著富集通路。
real-time qpcr验证
为了验证rna-seq数据的结果，我们选择了15个degs，其中7个来自最上调基因，8个来自最下调基因进行qpcr验证，其中大多数基因参与免疫功能，如免疫、代谢、解毒和抗氧化反应，这些反应蜜蜂是响应环境压力而激活的。如图4a和4b所示，与对照组相比，烯啶虫胺处理的蜜蜂的所有基因表达水平都有显著差异（图4a和4b），并且qpcr结果与测序结果一致。
图4 实时定量pcr验证rna-seq数据。（a）从最上调的基因中选择7个用于qpcr验证。（b） 从最下调的基因中选择8个用于qpcr验证
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