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发稿时间：2019-11-19来源：天昊生物

 

从本期开始小编将陆续对泛癌种单细胞转录组测序文章进行总结，展示每篇文章采用的研究方法、发现的主要结果以及提出的待解决的科学问题。某些癌种的单细胞转录组文章数量较多，目前仅讨论那些以单细胞转录组测序结果为主线的文章（不考虑单细胞转录组方法类文章、单细胞转录组只占论文一小部分的文章以及单细胞转录组数据挖掘类文章）。

 

我国肺癌的发病率位居癌症中首位，死亡率也是第一。以肺癌（lung cancer）为例，通过pubmed设置的多个关键词检索发现，截止到11月11日肺癌单细胞转录组文章共有6篇（单细胞转录组为主线内容），每篇文章关注的细胞类型和研究目的各不相同。现将这6篇文章的主要内容整理如下：

【一】

研究内容及方法

2015年4月份东京大学团队利用单细胞rna测序分析了不同肺腺癌细胞系间的基因表达模式的差异，并且在靶向药物处理条件下去研究每个细胞的转录组是如何变化的，亲代细胞和耐药细胞又有什么不同。研究人员利用fluidigm c1系统一共分析了7种细胞系的336个单细胞rna-seq文库。
主要研究结果

首先在方法学上验证了单细胞转录组测序对于单个细胞间的平均表达水平及相对基因表达差异的检测是十分可靠的。基因表达的多样性主要基于相应的基因和通路。利用多酪氨酸激酶抑制剂vandetanib处理后的单细胞结果显示，核糖体基因及其它所谓的看家基因的相对表达多样性在药物处理后会降低，然而vandetanib直接靶向的基因，如egfr和ret则保持不变。对这些基因的严格转录控制可能不允许其表达随药物治疗或耐药性的获得而发生可塑性变化。另外发现了癌症相关基因的表达模式有时会比起始细胞中预期的更加多样化。而且发现了这种多样性在正常状态下偶尔是潜在的，而在药物处理后才开始变得明显。基因表达差异的特征模式是无法利用传统的一群细胞的转录组方法展示出来，其在细胞获得耐药中可能发挥了重要作用，亦可能是通过为基因表达程序提供细胞储备。

观点和潜在问题

1.这篇文章是在转录组层面上首次描述肺癌细胞的异质性。2.文章所用到的细胞其细胞周期可能不一致，细胞微环境不能完全控制。3.无法评价在文库构建过程中系统偏差带来的影响。4.无法将观察到的差异的原因归结为新获得的基因突变或者表观基因组的改变。5.有必要对更多类型的细胞进行单细胞转录组测序以解释表型的多样性。

【二】

研究内容及方法

2015年6月韩国团队利用单细胞mrna-seq发现了肺腺癌细胞在抗肿瘤药物反应中出现的亚克隆异质性。研究人员从肺腺癌患者肿瘤移植模型（pdx）中分离了34个肿瘤细胞，利用fluidigm c1系统进行单细胞mrna-seq分析基因表达特征及表达的突变特征。文章同时也采用了普通的bulk细胞rna-seq和全外显子测序（wes）进行分析。

主要研究结果

发现了50个肿瘤特异的snv，包括kras^g12d，其在单个pdx细胞中具有高度异质性。利用半监督聚类，基于kras^g12d突变的表达和69个肺腺癌预后基因表达代表的风险评分（rs）可以将pdx细胞分成4组。体外抗肿瘤药物处理后存活的pdx细胞显示出与kras^g12d突变及低rs组一致的转录组特征。因此，通过对活的pdx细胞进行单细胞rna-seq能够发现与抗肿瘤耐药相关的候选的肿瘤细胞，单细胞rna-seq有助于揭示肿瘤特定细胞的表达特征，由此能够促进临床优化抗癌策略的制定。

观点和潜在问题

1.单细胞rna-seq能够提供基因表达和体细胞snv的综合信息，能够将细胞基因型、表达特征和表型联系起来。2.单细胞rna-seq和bulk rna-seq在表达和snv数据上异同。3.新鲜分离的肿瘤细胞对于评估肿瘤异质性可能比较重要。4.低rs的细胞反倒在药物处理中存活下来，可能与药物的作用靶点、耐药真实影响的细胞范围有关。

【三】

研究内容及方法

2016年11月意大利团队通过研究结直肠癌（crc）和非小细胞肺癌（nsclc）肿瘤组织中淋巴细胞转录组图谱发现了肿瘤浸润性调节t细胞的独特性。研究人员将crc或nsclc中浸润的th1, th17和treg细胞的转录组与正常组织中的进行比较（普通rna-seq），并且在单细胞水平上进行验证。其中单细胞的实验分别从5例crc和5例nsclc肿瘤样本中分离cd4 t细胞，以5名健康个体的pbmc样本作为对照；纯化treg细胞，利用fluidigm c1系统对总共858个treg细胞进行单细胞转录组分析（crc: 320; nsclc: 286; pbmc: 252）。

主要研究结果

发现了肿瘤浸润的treg细胞是高度被抑制的，上调了一些免疫检查点及其配体转录本的表达，如il1r2, pd-l1, pd-l2和ccr8趋化因子，而这些内容之前在treg细胞中未被发现。整个肿瘤组织样本中treg细胞特征基因（layn, mageh1, ccr8）的高表达与不良预后显著相关。这些结果对肿瘤浸润的treg细胞的分子特征和功能的揭示提供新的视角，并且对肿瘤的免疫治疗确定了潜在的靶点。
观点和潜在问题

1.不同癌种来源的肿瘤浸润treg细胞可能共享一些基因表达特征，肿瘤微环境会影响treg细胞的功能。2.有必要在不同的肿瘤浸润免疫细胞中评估checkpoints和其配体的表达。3.单细胞的分析能够很好地佐证全转录组的数据，为基因表达数据提供更多信息。4.ccr8在肿瘤浸润treg细胞中高度特异性的表达表明其可能作为抑制treg细胞的一个潜在靶点。

 

【四】

研究内容及方法

2018年6月北大张泽民组和北大三院闫天生组利用单细胞转录组测序揭示了nsclc中t细胞总体特征。利用smart-seq2方法对来源于14个未治疗的nsclc患者（11个腺癌，3个鳞癌）筛选的12,346个t细胞进行单细胞转录组测序，样本包括肿瘤组织，癌旁组织和外周血。

主要研究结果

基于谱系示踪联合表达和t细胞抗原受体分析发现了一种组织内的效应t细胞具有很高比例，而且具有高度的迁移本性。和肿瘤浸润的cd8 t细胞会经历耗竭一样，观察到两簇细胞也表现出耗竭前的状态，而且一种高比例的“预耗竭”到耗竭状态的t细胞与肺腺癌的良好预后相关。另外，在肿瘤调节性t细胞（tregs）中观察到的异质性以tnfrsf9（抗原特异性tregs的一种激活marker）的双峰分布为特征。那些激活的肿瘤tregs基因特征，包括il1r2，与肺腺癌的不良预后相关。这项工作为患者的分层提供了新的方法，也为进一步理解肺癌中t细胞的功能状态和动态变化提供了重要支撑。

观点和潜在问题

1.激活的肿瘤tregs细胞的临床意义值得进一步研究。2.t细胞的组成对于nsclc的分型可能是一项重要的biomarker。3.肿瘤浸润性淋巴细胞的详细分类对于当前的免疫治疗药物的区分选择可能比较重要。4.单个免疫细胞表征的方法具有高维性和高的分辨率，同样适用于其它癌种的研究。

【五】

研究内容及方法

2018年7月比利时团队利用单细胞转录组测序技术揭示了nsclc肿瘤微环境（tme）中的基质细胞表型特征。研究人员利用10x genomics公司的chromium系统对来源于5位患者的52,698个细胞进行单细胞转录组测序，分析其肿瘤微环境转录组特征，并且在3个额外样本的40,250个细胞中进行验证。

主要研究结果

通过与相应的非恶性的肺组织比较，发现高度复杂的肿瘤微环境深刻塑造了基质细胞。其中发现了52种基质细胞亚型，包括迄今被认为是同种细胞类型的新的亚群，以及决定其异质性的转录因子。例如，发现了成纤维细胞表达不同的胶原蛋白，内皮细胞下调了免疫细胞归巢以及一些与已确立的免疫检查点转录本共调控的基因的表达，这些基因与t细胞活性相关。通过评估来自1,572名患者的bulk rna-seq数据中这些细胞亚型的标记基因，阐明了这些marker基因如何与患者生存相关，而对选定的marker基因进行免疫组化验证其在一系列独立的肺肿瘤中是作为独立的细胞实体。因此，这项研究通过表征基质细胞的表型和同化方式（co-optive behavior）提供了一个全面的基质细胞类型的目录，这一资源为肺癌生物学提供了更深入的了解，并将有助于促进肺癌的诊断和治疗。
观点和潜在问题

1.亚型是代表不同的细胞类型，还是代表细胞在应对tme刺激下所获得的状态仍不清楚，至少在一定程度上是语义问题。谱系示踪（lineage tracing）是进一步阐明这一点的一个有吸引力的途径。2.尽管在一些肿瘤中检测到多种基质细胞亚型，但这些基质细胞表型是否也存在于影响其他器官的肿瘤中，以及它们是否在肺肿瘤转移到其他器官时复发。3. 鳞状细胞瘤的许多基质细胞标记物与存活率呈负相关，与肿瘤分期无关。这种差异是否反映了基质细胞对鳞状癌细胞生物学的真正影响仍有待阐明。观察到一些标记基因与不同队列的生存密切相关，至少说明这些亚型特异性标记基因可以作为预后和治疗反应监测的生物标志物。4. 肿瘤基质中基因表达的改变为治疗的设计提供了方向。

【六】

研究内容及方法

2019年4月美国团队利用单细胞转录组技术发现人和小鼠肺癌中的骨髓细胞群具有个体和物种间的保守性。研究人员利用indrop的方法分析了7例人的肺癌组织样本（5例腺癌，2例鳞癌），2例小鼠肺癌组织及2例健康小鼠对照样本（小鼠样本筛选了cd45 细胞），主要研究对象集中在免疫细胞亚群上。同时将患者肿瘤中的免疫细胞与血液中的做了对比。

主要研究结果

肿瘤浸润性骨髓细胞（tims）主要由单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和中性粒细胞组成，其已成为癌症生长的重要调控因素。这些细胞可以分化成一系列状态，这些状态可能促进或限制肿瘤的生长，但对其了解甚少。这篇文章利用单细胞转录组测序技术对非小细胞肺癌患者的tims进行表征，发现了25中tim状态，其中大多数在患者中可以被重复发现。为了促进这些亚群的转化研究，同时对小鼠的tims进行研究。对物种间的tims进行比较发现树突细胞和单核细胞的群体结构几乎完全一致，中性粒细胞的子集也具有一定的保守性，而巨噬细胞则有一定的物种差异性。相比之下，患者血液中的髓细胞群结构与tims中的重叠有限。这项研究确定了肺tim的图谱，为进一步研究tims作为免疫治疗靶点的潜力奠定了基础。

观点和潜在问题

本项研究的三点局限性：1. 分析更多的患者可以发现更多的tim亚型；2. 分析更多的细胞可以进一步细化tim的异质性；3.在与小鼠的比较中，仅仅使用了一个肺腺癌的模型，因此，当小鼠和人类之间出现差异时，就不知道这些差异是否由物种特异性差异造成。除此之外，这项研究还发现血液中的髓细胞很难反映tim的状态。

天昊生物

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