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发稿时间：2019-07-31来源：天昊生物

文章标题：single-cell rna-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma

期刊杂志：cell research (if: 17.848)

发表时间：2019年7月4日

研究单位：北京协和医院、中国科学院北京基因组研究所等

研究背景

基因组和转录组研究已经发现一些关键的基因突变或异常的信号通路驱动着胰腺导管腺癌（pdac）的发病，如kras、tp53、smad4，tgf-β、notch信号通路等，然而这些发现还并未有临床转化。同时pdac细胞间存在瘤内异质性，因此基于细胞群的mrna测序去发现遗传变异变得更具有挑战性，利用细胞群分析瘤内异质性的技术限制也阻碍了发现切实可行的诊断标志物和治疗靶点。近来单细胞基因组和单细胞rna测序技术为揭示遗传和功能异质性、细胞亚群、进化谱系重建、肿瘤相关机制等提供了重要的工具。

主要研究思路及方法

24例原发性pdac肿瘤样本 vs 11例对照胰腺样本

57,530个细胞（41,986 cells from pdac and 15,544 cells from control pancreases）

10x genomics 3’单细胞转录组测序

主要研究结果

1. single-cell expression atlas and cell typing in pdac tumors and control samples（单细胞表达图谱）

来源于24例pdac肿瘤样本和11例对照胰腺样本的共计57,530个细胞图谱，主成分分析能够发现10种主要的细胞类别，包括1型导管细胞、2型导管细胞、腺泡细胞、内分泌细胞、内皮细胞、成纤维细胞、星形细胞、巨噬细胞、t细胞和b细胞。

不同的cluster具有特定的marker基因，细胞特定的marker可以用来识别细胞类型，如导管细胞中的krt19，腺泡细胞中的prss1等。

2. cnv landscape distinguishing malignant ductal cells in pdacs（cnv数据区分细胞）

为了鉴别恶性的细胞，基于平均的表达模式可以计算大规模的染色体拷贝数变异（cnv）。其中2型导管细胞比1型导管细胞和其它细胞具有显著更高的cnv水平。

对两种类型的导管细胞表达模式分析发现3107差异表达的基因，功能富集分析显示2型细胞中上调的基因主要富集在癌症相关的功能，如细胞增殖、迁移和缺氧，进一步验证了这种亚型的恶性状态。1型细胞中上调的基因与正常的胰腺功能相关，包括消化、胰腺分泌和碳酸氢盐运输，表明1型细胞仍然具有一定程度的导管细胞的正常功能。利用免疫组化染相应的marker也能验证两种导管细胞的存在，也验证了2型细胞是pdac恶性细胞的主要来源。

到底哪种胰腺细胞类型负责肿瘤的起始仍不得而知，对异常的1型细胞和恶性的2型细胞基因表达特征进行拟时分析（腺泡细胞太少，无法进一步分析过渡状态）。对pdac进展轨迹中的所有基因表达模式分析发现2299个基因具有动态的变化，将这些基因分成4种异常的表达模式（p1-p4）和4种恶性的表达模式（p5-p8），多种关键的调控因子和转录因子被激活参与到pdac的肿瘤形成过程。

3. distinct subgroups in malignant ductal cells（恶性导管细胞中的不同亚群）

基于t-sne分析将2型导管细胞进一步分成7个亚群，对每个亚群进行功能富集分析发现第七个亚群与细胞周期和细胞增殖的功能相关，其中增殖相关的marker有特定的表达，如mki67、top2a、ccnb1和ccnb2。

4. gene expression pattern analyses in tcga paad samples based on malignant ductal markers（基于恶性的导管细胞marker分析tcga样本的基因表达特征）

利用恶性导管细胞marker对tcga中178例胰腺癌样本（146例pdac，32例非pdac）进行聚类分析，结果发现所有样本可以分成3个pdac的cluster及1个非pdac的cluster。同时，增殖相关的marker与其它marker明显被区分开，主要集中在cluster2和cluster3中。恶性导管细胞marker可以有效地区分pdac患者和其它类型的胰腺癌患者。

然后利用增殖相关的marker分析其预后价值，发现根据表达水平能够将pdac患者分成3个亚群，其中group3有显著更高的增殖marker，而且其生存率显著更低。利用特定的药物靶向增殖相关的marker（cdk1、plk1、aurka），这些抑制剂能够显著地抑制细胞增殖。

再比较group3和其它两组间的tcga转录组数据，发现759个上调的基因，946个下调的基因。功能富集分析显示上调的基因富集在细胞周期、dna复制和dna修复，下调的基因富集在t细胞选择、淋巴细胞激活上。

再将这些差异表达的基因在单细胞数据中分析其表达模式，发现很多上调的基因主要表达在2型导管细胞中，而下调的基因主要位于巨噬细胞和t细胞中，表明异常的导管增殖和免疫反应同时在肿瘤微环境中发生。

5. inactivation of t cells in pdac patients with high abundance of proliferative ductal markers（高丰度的增殖marker患者中t细胞失活）

为了评价pdac中浸润t细胞的功能，利用tcga数据分析pdac基质中t细胞激活状态，发现增殖marker高表达的样本中t细胞marker表达却更低，单细胞测序数据中也能发现这种负相关的关系，同时利用免疫染色验证了这种关系。

总结讨论

总体上这些结果为揭示pdac中异质性细胞的基因表达图谱、pdac瘤内异质性的机制提供了宝贵的资源，同时关键的信号通路可能调控瘤内异质性的发生及pdac的肿瘤进展。10x genomics chromium系统被评价为最优化的商业平台，包括其分子灵敏度、准确性及最低的技术噪音等方面均优于其它的高通量单细胞转录组测序平台，如indrop和drop-seq。