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发稿时间：2019-04-01来源：天昊生物

南京师范大学地理科学学院近期在《applied soil ecology》上发表了在还原性土壤除害过程中瘤胃球菌科，毛螺菌科和梭菌科是优势菌群的文章。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的扩增子测序工作。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：the families ruminococcaceae, lachnospiraceae, and clostridiaceae are the dominant bacterial groups during reductive soil disinfestation with incorporated plant residues

中文题目：在还原性土壤除害过程中瘤胃球菌科，毛螺菌科和梭菌科是优势菌群

期刊名：applied soil ecology   

影响因子：2.916

研究概要：

还原性土壤除害（rsd），又称生物性土壤除害或厌氧性土壤除害，是一种控制土壤传播疾病的环境友好型方法。微生物被认为是rsd的关键因素，这对于理解rsd的机制是至关重要的，然而关于这些重要微生物的信息有限。本研究在盆栽试验中对4种土壤进行了rsd处理，利用16s rdna扩增子测序检测了rsd过程中存在的细菌群落。结果表明，rsd显著改变了土壤细菌群落结构，降低了细菌的丰富度和多样性。厚壁菌门相对丰度显著增加，放线菌门和酸杆菌门相对丰度降低。属于厚壁菌门的瘤胃球菌科，毛螺菌科和梭菌科是土壤rsd过程中的三大优势菌科。瘤胃球菌科和毛螺菌科，而不是梭菌科与rsd期间的ph下降密切相关，这被认为是短链脂肪酸积累的一个指标。除这些细菌群外，在rsd处理过的土壤中，芽孢杆菌目、细菌科、伯克氏菌目和拟杆菌目也很丰富。综上所述，rsd处理、土壤类型及其相互作用共同影响了rsd处理土壤中的细菌群落组成。

研究背景:

由特定病原体引起的土传植物疾病已成为一个全球性的问题，严重威胁农业可持续发展。以前，农民使用化学杀虫剂，来杀死土壤传播的致病微生物。然而，由于人们越来越担心食品安全和环境污染，这些化学农药的使用正逐渐受到限制。因此，许多研究人员正在寻找管理土传病原体的替代方法。2000年，日本和荷兰分别开发了还原性土壤除害（rsd），也称为生物土壤除害或厌氧土壤除害，作为化学土壤除害的潜在替代品。rsd的概念是提供不稳定的有机基质，在被塑料薄膜覆盖的潮湿土壤中刺激微生物驱动的厌氧土壤条件。该方法已被证明对多种土壤传播的病原菌有效，如镰刀菌、青枯菌、大丽轮枝菌、腐霉、黄连白绢病菌和疫霉，以及非同源性线虫和短体线虫。然而，rsd的确切机制尚不清楚。普遍认为，土壤微生物群落在rsd过程中发生了显著变化，优势微生物在rsd机制中起着重要作用。这些微生物要么由一些拮抗剂组成，要么产生拮抗化合物，如乙酸、丁酸、fe² 和mn² ，从而从土壤中清除病原体。由于大多数真菌生长在有氧条件下，在rsd过程中的功能微生物通常是细菌，其中许多是厌氧菌或兼性厌氧菌。然而，只有少数研究对rsd过程中的优势菌进行了研究。在这些研究中，使用基于16s rrna基因序列的变性梯度凝胶电泳和克隆文库分析显示，梭菌属、氧杆菌属和芽孢杆菌属是rsd处理土壤中最优势的细菌。然而，由于土壤的多样性和复杂性以及添加的有机质，在不同的土壤中利用不同的有机质进行rsd可能会导致不同细菌群的优势。我们仍然不确定是否有其它优势细菌可能出现在不同的rsd处理土壤。本研究以4种致病性农业土壤为研究对象，采用miseq测序方法，对未处理和rsd处理土壤中的细菌群落进行了比较，并对rsd处理过程中的优势菌群进行了研究。

研究对象：

土壤和有机基质

本研究中使用的四种土壤（jf、bg、hx和nt）如表1所示。由于连续单季种植，这些土壤严重感染土壤传播的病原体（表1）。土壤从4个农业地点采集，深度在3-20厘米之间，每种土壤样品被彻底混合，用于孵化试验。玉米秸秆和苜蓿晒干，切碎，作为有机基质进行rsd处理。玉米秸秆和苜蓿中的总有机碳和氮分别为428.7 g kg^-1和7.49 g kg^-1和399.1 g kg^-1和13.5 g kg^-1。

实验设计

对每种土壤进行对照（ck）和rsd两种处理。表1描述了四种土壤的rsd处理,加入玉米秸秆和苜蓿等有机基质（1%，w/w）后，将土壤（100克装在圆柱形容器中；直径5厘米；高度8厘米）灌至饱和,并用两层塑料膜（聚乙烯，透明，厚度0.1mm，透氧性低）密封,然后将土壤在30°c下培养15天。ck处理的土壤没有用有机基质(玉米秸秆和苜蓿)进行改良，也没有密封，在培养过程中其含水量保持在14-18%。每种处理分三次进行。培养结束时，经rsd处理的土壤的氧化还原电位（eh）在−23.7 mv到−87.5 mv之间，表明达到了降低的条件。然后，立即采集土壤样本，并进行dna提取。

表1本研究中使用的四种土壤和处理方法的说明

miseq测序：细菌测序区段（v4）；

研究结果：

细菌群落的丰富性和多样性

双向方差分析表明，rsd处理、土壤类型及其相互作用对细菌多样性有显著影响。nt土壤中细菌ace和香农指数明显高于其他土壤。单因素方差分析表明，与对照土壤相比，rsd处理后的jf和bg土壤细菌ace指数显著降低。相比之下，rsd处理的hx和nt土壤中的细菌ace指数没有显著差异。rsd处理的jf和nt土的香农指数显著低于相应的ck土壤。与相应的ck土壤相比，rsd处理的bg和hx土壤的香农指数略有下降，但不显著（图1）。

图1土壤细菌群落指数ace和shannon

与对照组相比，rsd处理土壤中的特异otu更少。在rsd处理的jf、bg、hx和nt土壤中，特异otu分别占总otu的80.2%、48.2%、46.6%和66.6%（图2）。

图2 对照（ck）土壤和还原性土壤除害（rsd）处理土壤中共享和特异的otus。

细菌群落的pca

采用主成分分析法（pca）对rsd处理和对照土壤样品中细菌群落的异同进行了评价。rsd处理和未处理的ck土壤样品之间存在着主要的差异，而不是不同土壤类型之间的差异。permanova进一步证实，rsd处理、土壤类型及其相互作用对细菌群落有显著影响（p<0.001），三个因子中的r²分别为0.47、0.30和0.15。此外，在rsd处理过的土壤样本中，厚壁菌门firmicutes是最重要的分布决定因素，其次是actinobacteria, chloroflexi, acidobacteria, planctomycetes, gemmatimonadetes（图3）。

图3 还原性土壤除害（rsd）处理（红色）和对照（ck）（黑色）土壤样品细菌群落的主成分分析

土壤中的优势菌群

在多个分类水平上，细菌组成显著受rsd处理、土壤类型及其相互作用的影响。在门水平上，rsd处理后的jf、bg、hx和nt土壤中厚壁菌门的相对丰度比相应ck土壤高3.92、11.32、3.00和25.57倍。在不同土壤中，jf土壤中厚壁菌门的相对丰度最高。另外，与相应对照土壤相比，rsd处理土壤中放线菌门和酸杆菌门的相对丰度也显著降低（图4）。

图4 对照（ck）和还原性土壤除害（rsd）处理土壤中细菌门的相对丰度

在目水平上，梭菌目属于厚壁菌门，是主要的细菌目，在rsd处理的jf、bg、hx和nt土壤中，其相对丰度显著增加了62.9%、28.4%、10.6%和35.1%。在不同土壤中，jf土壤中梭菌目相对丰度最高。相比之下，在rsd处理的jf和hx土壤中相对丰度降低的主要细菌目是放线菌目，在rsd处理的bg和nt土壤中相对丰度降低的主要细菌目是酸杆菌目和噬纤维菌目（图5）。

图5 与对照土壤相比，还原性土壤除害（rsd）处理的jf、bg、hx和nt土壤中细菌数量相对增加和减少

在科水平上，经rsd处理的jf、bg和hx土壤中的瘤胃球菌科和梭状芽孢杆菌科显著增加，在rsd处理的jf和hx土壤中，毛螺菌科显著增加。除了rsd处理土壤中富集的常见菌科外，每种土壤类型中也富集了一些特异的细菌科，如jf中的鞘氨醇杆菌科和肠杆菌科；bg中的杆菌科和拟杆菌科中的非分类细菌；hx中的黄单胞菌科和类芽孢杆菌科；nt中的消化链球菌科、ignavibacteria科和rhodocyclaceae（图6）。

图6 与对照土壤相比，还原性土壤除害（rsd）处理的jf、bg、hx和nt土壤中细菌科的相对丰度增加和减少

土壤ph，除害效率和优势菌群的关系

rsd处理后，四种土壤的土壤ph值变化显著不同。pearson’s相关分析表明，土壤ph变化（由rsd处理引起）与rsd处理土壤中厚壁菌门的相对丰度呈显著负相关，土壤初始ph（与土壤类型相关）与土壤中酸杆菌和放线菌的相对丰度呈负相关。梭菌目（rsd处理土壤中的主要细菌目，属于厚壁菌门）的相对丰度与土壤ph变化呈负相关，与土壤初始ph呈正相关。与此相反，放线菌目（放线菌门的主要目）的相对丰度与土壤ph变化呈正相关，与土壤初始ph呈负相关。作为梭菌目的两个主要科，瘤胃球菌科和毛螺菌科的相对丰度与土壤初始ph呈正相关，与土壤ph变化呈负相关，而梭菌目的另一个主要科，梭菌科的相对丰度与土壤初始ph以及土壤ph变化不相关。同样地，土壤ph与梭菌属、粪球菌属和uc瘤胃球菌科的相关性与梭菌目、毛螺菌科和瘤胃球菌科的相关性相似。病原菌丰度与厚壁菌门及其科，如梭菌科、瘤胃球菌科、毛螺菌科呈显著负相关，与酸杆菌门、放线菌门、 绿弯菌门、芽单胞菌门和浮霉菌门呈显著正相关（表2）。

表2土壤ph、病原菌丰度与优势菌群相对丰度的pearson’s相关系数