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发稿时间：2019-03-19来源：天昊生物

南京农业大学近期在《applied microbiology and biotechnology》上发表了参与bt水稻秸秆分解的活性微生物研究的文章。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的扩增子测序工作。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目： probing active microbes involved in bt-containing rice straw decomposition

中文题目：参与bt水稻秸秆分解的活性微生物研究

期刊名：applied microbiology and biotechnology    

影响因子：3.34

研究概要：

转基因苏云金芽孢杆菌（bt）水稻对害虫的防护作用显著，满足了日益增长的食物和能源需求。许多研究已经对bt水稻对农业生态系统的影响进行了研究，但对于确定bt水稻的存在如何影响和塑造微生物群落，特别是活性微生物的研究却很少。稳定同位素探测和高通量测序被用于检测参与bt秸秆分解过程中的活性微生物。与近等位线相比，bt秸秆中总氮、总磷、总钾、木质素、纤维素和cry1ab毒素蛋白含量较高，这些化学差异对分解速率没有影响，但对具有分解活性的微生物菌群落有显著影响。在bt秸秆的分解过程中，真菌的影响大于细菌。壤霉菌属、地杆菌属、细杆菌属、糖霉菌属和kribbella是最具代表性的细菌属（仅存在于bt处理组，并在早期出现）；木霉是bt秸秆分解过程中最具代表性的独特真菌属。通过相似指数计算和功能预测，发现bt秸秆和非bt秸秆处理的微生物类群和功能性状存在显著差异，这些结果表明，在微生物分解秸秆方面，bt水稻对土壤微生物具有显著而短暂的影响。

研究背景：

水稻是世界上主要的粮食作物，对转基因水稻的开发已久，在水稻中引入外源基因有可能保持或提高产量，其中一个途径是提高水稻对害虫的抗性。转基因苏云金芽孢杆菌（bt）水稻表达杀虫蛋白，最早于1989年开发，这种转基因水稻显示出对害虫的高度防护，从而减少了化学杀虫剂的使用。然而，bt水稻所含的cry蛋白通过bt水稻残基和根系分泌物释放到土壤中，因为微生物是土壤生态系统的核心，这一现象是否对土壤微生物群落有着深远的影响是至关重要的，此前已经开展了广泛的研究，以研究bt作物对土壤生态系统的各种影响，但对于bt水稻的存在如何影响和塑造微生物群落，人们的关注却很少。据报道，用bt稻秸和非bt稻秸对水稻土进行早期改良，可培养的好氧菌、放线菌、真菌、厌氧发酵菌、反硝化菌、产氢产醋酸菌、产甲烷菌在水稻土中有一些偶然的、显著的变化。同样，在稻田根系分解早期，bt水稻根与非bt水稻根处理的真菌群落组成也存在显著差异。然而，一些研究表明，bt水稻的种植对土壤微生物群落的影响很小或没有。以往的研究表明，在植物基因组中引入外源基因可能改变植物残基的组成，进而影响有机质分解和土壤养分循环。稻草可以直接返回农田，也可以在堆肥后作为有机物返回，以提高土壤肥力。这些常见的农业实践将大大增加种植bt水稻对土壤微生物的影响，因此，在评估bt作物种植影响时应更加关注bt秸秆的影响。

积极利用bt水稻碳资源的微生物不能与那些在土壤中分解遗传有机物的微生物区别开来，甚至在使用常规方法（总dna测序）时也不能与那些没有生命的微生物区别开来。稳定同位素探测（sip）为鉴定消化特定底物的微生物并分析其在环境中的作用提供了一种与培养无关的方法。据报道， ¹³c脉冲示踪结合磷脂脂肪酸（plfa）分析表明对bt水稻根际微生物群落组成无持续或不利影响。然而，采用¹³c脉冲追踪标记结合克隆文库的研究发现，bt水稻根际存在一种修饰过的活性产甲烷古菌群落。对bt水稻（甚至其它bt作物）秸秆分解过程中的活性微生物相关研究较少。2007年，利用¹³c标记植物残基进行了第一次dna-sip实验，研究了小麦残基的分解过程，采用等密度梯度超离心法从总提取dna中提取¹³c标记的dna，用于活性微生物的进一步分析。随着高通量测序技术的推广，与传统的dgge、t-rflp等方法相比，可以在更高的分辨率和深度上探索微生物群落。dna-sip和高通量测序相结合的方法将为研究bt水稻中的活性微生物提供新的视角。

本研究的目的是在水稻土中加入¹³c标记的bt稻草，并对其降解过程中的活性细菌和真菌群落进行研究。将¹³c标记的bt稻草与土壤均匀化，培养5周以上。为了更好地分析土壤中吸收¹³c标记的bt稻草中碳的活性微生物动态，通过监测土壤呼吸来校准采样时间点。关于微生物群落结构和多样性，采用高通量测序技术对秸秆分解过程中活性微生物群落的动态特征进行了研究，同时利用picrust和funguild分别推断细菌和真菌的功能。本研究探讨了bt水稻对微生物类群和功能的影响。为了确定bt水稻对土壤微生物群落是否有深远影响，本研究的重点关注两个主要问题：（i）bt水稻与其非转基因亲本之间在参与秸秆降解的活性微生物上存在无差异、微小差异或显著差异？（ii）参与bt稻草分解的活性微生物是什么？

miseq测序：细菌测序区段（v4-v5）； 真菌测序区段（its2）

研究结果：

bt和非bt秸秆的性能差异明显

bt秸秆总氮、总磷、总钾、木质素和纤维素含量高于非bt秸秆，仅在bt秸秆中检测到cry蛋白。本研究中bt和非bt秸秆中半纤维素的含量没有显著差异（表1）。

活性微生物群落组成在bt和非bt处理之间有显著区别，并随时间推移而变化

考虑到土壤呼吸的趋势，添加秸秆后1周、3周和5周分别进行3次采样。wk1（第一周）、wk3（第三周）和wk 5（第五周）分别定义为秸秆分解的早期、中期和后期。bt处理和非bt处理下土壤呼吸无显著性差异。¹³c标记菌群的nmds分析表明bt和非bt处理在垂直轴上存在差异，并根据不同的采样时间在水平轴上产生连续的点（图1a）。此外，permanova显示¹³c标记细菌群落与转基因和时间有显著的相关性。¹³c标记的真菌群落的nmds排序与细菌群落的nmds排序相似（图1b）。在细菌和真菌群落中，时间的影响远远大于转基因的影响。

图1基于bray-curtis相似指数的活性微生物群的nmds排序。不同的颜色代表不同的处理和采样时间点。a细菌群落,b真菌群落。

bt和非bt秸秆分解中的共享和独特物种

bt和非bt秸秆处理共享部分类群，streptomyces链霉菌是bt和非bt秸秆处理中最具优势和活性的一个属（图2a）。本研究所鉴定的五种链霉菌中，有一种（botu57）只存在于bt秸秆处理中，其丰度相对较低。链霉菌的其他种类（botu1, botu2, botu4, botu5）在bt和非bt秸秆分解过程中均表现出很高的相对丰度，并存在于各个时期。然而，在bt和非bt秸秆处理下，这些共有的物种表现不同，它们要么随时间逐渐增加或减少，要么只在某一时期存在，此外它们的相对丰度在不同的处理中也不同。此外，xanthomonadales黄单胞菌属的两个溶菌属（botu7 和 botu9）、一个dyella sp.属（botu12）和一个红杆菌属（botu6）以及一个massilia属（botu13）表现出与streptomyces链霉菌相似的特性，尽管它们的相对丰度低于链霉菌属。

bt秸秆处理具有独特的分类群，例如属于micrococcales微球菌的5个物种中有4个是bt处理独有的：2个农杆菌属（botu19和botu28）在整个培养过程中都存在，而地杆菌属（botu18）和微杆菌属（botu34）只存在于早期。除此之外，早期还存在糖酵母菌属（botu62）和链霉菌属（botu57）；早期和中期还存在kribbella属（botu16）；晚期还存在螯合球菌属（botu24）。

相反一些类群只在非bt秸秆处理下出现，例如，vulgatibacter sp. (botu39)仅在早期存在。除此之外，devosia sp. (botu44), altererythrobacter sp. (botu31), 四个未分类群 (botu36, botu20, botu60, botu124)仅在中期出现。

图2最具活性out聚类分析。不同的气泡大小代表不同的丰度。优势共享类群以红灰色标记，bt秸秆处理独特类群以蓝灰色标记，非bt秸秆处理独特类群以黄灰色标记。标记的分类群共享的最高分类分辨率标记在气泡图的右侧。a细菌群落。

真菌种类分布较均匀，主要是ascomycota子囊菌属和mucoromycotina粘液菌属（图2b）。紫锥菌属（fotu 1）是bt和非bt秸秆处理最活跃的真菌类群。属于aspergillaceae曲霉科的3种penicillium spp.青霉属（fotu13、fotu25和fotu54）和3种aspergillus spp.曲霉属（fotu27、fotu31和fotu34）也被bt和非bt秸秆处理所共有，并且占据优势地位。

与细菌类群相似，一些真菌类群是bt秸秆处理的特有类群。在早期阶段，出现了zopfiella sp. (fotu32)，中期出现了alternaria sp. (fotu97)和neonectria sp. (fotu105)。值得注意的是，木霉菌trichoderma sp. (fotu128)在各个阶段都存在。

相比之下，一些分类群lichtheimia sp. (fotu60)和两个非分类种(fotu122 and fotu623)出现在后期，并且是非bt秸秆特有的。

图2最具活性out聚类分析。不同的气泡大小代表不同的丰度。优势共享类群以红灰色标记，bt秸秆处理独特类群以蓝灰色标记，非bt秸秆处理独特类群以黄灰色标记。标记的分类群共享的最高分类分辨率标记在气泡图的右侧。b真菌群落。

bt与非bt秸秆处理后活性群落的相似性指数在后期有所增加。

所有与秸秆分解有关的微生物都被定义为labeled标记群落（或活性群落）。此外相对丰度大于1%的标记类群被认为是abundant丰富群落。根据bray-curtis距离，计算并比较了不同分解阶段bt和非bt秸秆处理的labeled标记群落（图3，右）和abundant丰富群落（图3，左）的相似性指数。就abundant丰富群落而言，在细菌群落（图3a）和真菌群落（图3b）中bt和非bt处理之间的相似性随时间而增加；在labeled标记群落方面，相似性下降，然后增加。最后，无论是labeled标记群落还是abundant丰富群落，bt和非bt秸秆处理细菌群落的相似性总是高于真菌。

图3 bt和非bt秸秆处理后活性群落（丰富或标记群落）的相似性。a细菌群落的相似性, b真菌群落的相似性。

bt和非bt秸秆处理之间细菌功能相似但真菌功能不同

通过picrust预测细菌功能，由于本研究的重点是秸秆分解，因此仅考虑与代谢相关的结果。无论是转基因还是孵育时间预测结果都非常相似（图4a），氨基酸代谢和碳水合物代谢是细菌最主要的功能。

图4不同处理过程中活性微生物群落的预测功能。a细菌功能。

用funguild预测真菌功能，与细菌功能不同，bt和非bt秸秆处理的真菌功能明显不同，并随时间变化（图4b）。值得注意的是，bt和非bt秸秆处理之间真菌功能的相似性随着时间的推移而增加。

图4不同处理过程中活性微生物群落的预测功能。b真菌功能。

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