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发稿时间：2019-03-14来源：天昊生物

 

植物dna甲基化一直是表观遗传学研究的热点领域。3月4日刚刚发表在nature plants上的文章，就巧妙的利用了反向重复序列（ir）转基因的方法，定向提高了目标区域dna甲基化水平，达到了调控下游基因表达的目的，为表观调控研究提供了新的思路和方法。

 

flowering locus t（ft）在长日照下调控拟南芥开花过程中起着重要作用。ft在叶片中的表达取决于转录起始位点(tss)上游5 kb远端转录增强子block c。研究人员表达block c的反向重复序列（ir）来诱导局部dna甲基化和异染色质形成，导致诱导光周期中ft表达下调。利用靶向dna甲基化作为工具来研究ft基因座的未知调控区域，研究者将位于基因下游1kb的block e鉴定为ft的新增强子。分析发现block c和block e在十字花科中是保守的，位于可接近的染色质中，充当加性转录增强子。其与近端ft启动子结合，控制ft表达来完成对光周期的响应。

 

 

转录增强子是多种转录因子的结合平台。增强子被证明与目标基因的启动子有物理上的相互作用，在那里它们参与转录因子等的招募。到目前为止，与动物中的增强子相比，植物中的增强子相对较少。

在植物中，从头合成的dna甲基化是通过rna依赖的dna甲基化(rddm)途径建立的。根据该机制，利用反向重复序列(ir)表达产生的双链rna，被直接加工进入rddm途径，从而对特定区域进行靶向dna甲基化，这提供了一种通过转录基因沉默(tgs)来改变基因活性的方法。在拟南芥中，ir介导的tmm和ft启动子的dna甲基化诱导了tgs。在这里，本研究了证明ir介导的dna甲基化可以抑制远端调控区的活性，使人们能够发现新的调控区，并研究它们在天然基因组环境中对基因表达的影响。

 

实验方法

目标区域dna甲基化克隆测序、chip-qpcr、小rna测序、gus组织化学染色等。

 

实验结果

ir诱导转基因植株晚花

在哥伦比亚(col-0)野生型拟南芥背景(wt)中产生表达block c ir靶向block c处dna甲基化，并评估转基因株系对ft表达的影响 (图1a，b)。在强ft诱导的长日照(16h light/8h黑暗)和中等诱导的日照条件(12h light/12h黑暗)下，评估每一代的开花时间。为了比较不同世代的开花时间，在等日照条件下，每一个株系同时生长四代( t3至t6)。与野生型相比，转基因株系的开花明显延迟，而非转基因株系的开花略有延迟(图1c)。在长日照条件下，检测了t3代和t6代的四个株系的ft表达及对应于它们各自的开花表型。转基因株系no.15-2和no.27-4的ft表达显著降低，而非转基因株系no.15-3和no.27-3并没有 (图1e)，说明ir靶向block c的存在与诱导光周期的延迟开花和ft表达减少明显相关。

 

图1、block c ir转基因植物出现花期延迟和ft表达下调现象

 

dna甲基化和异染色质形成在block c被诱导

先前的研究表明，dna甲基化介导的tgs需要24-nt的小rna(smrna)。ir的表达产生dsrna，其可由dicer like 3 (dcl3)处理后整合进入rddm路径。研究者在t6代对转基因和非转基因株系的smrnas进行测序，发现smrnas仅在转基因株系中特异性地定位到ir靶向区域。因此，产生smrna需要ir的存在，这仅限于ir茎环的内部400bp (图2a)。定位到的ir目标区域主要为21-nt长smrna，接着是22-nt和24-nt smrna(图2b)。转基因株系no.27-4产生的smrnas是株系no.15-2的大约7倍，但是ft表达的减少在这两个株系中是相当的，表明该途径中smrnas是饱和的(图2a，b)。

研究者之后用亚硫酸氢盐处理来检测block c的dna甲基化水平，证实了之前报道的col-0野生型幼苗中block c不存在dna甲基化(图2c)。在转基因株系中，dna甲基化在包括block c的ir靶区被诱导。利用dna甲基化克隆测序（至少10个克隆/位置）的方法，检测了单胞嘧啶位置上dna甲基化水平从10%到100%不等(图2c)。dna甲基化也在ir靶区两侧100bp检测到，尽管没有smrnas定位到这些区域(图2c)。为了评估dna甲基化的扩散范围，选择位于block c和ft tss之间的300bp区域作为对照。在对照区没有观察到dna甲基化，表明dna甲基化没有从block c向ft的tss扩散。之后比较了t3代和t5代的dna甲基化水平，发现cg甲基化在两个转基因株系中得以维持，在非转基因株系中维持的程度要低得多，no.15-3株系为约10 %，no.27-3株系极少。在没有转基因的情况下cg甲基化从t3代维持到t5代(图2d)。chh甲基化在转基因株系中随着世代的进展而降低，而在非转基因株系no.15-3和no.27-3中几乎为零(图2d)。总的来说，这些结果表明，ir丢失时，cg甲基化得到部分维持，维持水平因株系而异。

甲基化的dna可以招募组蛋白甲基转移酶kyp，这将组蛋白h3的赖氨酸k9二甲基化(h3k9me2)，导致染色质致密化。h3k9me2反过来又分别招募环境中的cmt2和cmt3来促进chh和chg的dna甲基化。本研究使用染色质免疫沉淀(chip)检测了ir诱导的dna甲基化是否导致h3k9me2在block c沉积。在两个独立的实验中，与野生型相比，转基因株系中h3k9me2水平增加，而非转基因no.15-3株系没有观察到增加(图2e)。

 

图2、在含有ir转基因植物中block c区域 dna被甲基化

 

ft由下游增强子block e调节

由于ir靶向block c造成其dna甲基化，进而下调了ft表达，本实验用这种方法检测了可能参与ft表达的其他区域(图3a )。研究者为先前识别的block b和一个被描述为col-0插入区域设计了irs，该区域存在于大约25 %的拟南芥材料中(图3a)。基于前人3c数据，这些区域对应于显示与近侧ft启动子相互作用的两个不同区域。dna甲基化以前在block b没有报道过，而col-0插入显示带有甲基化。irs的表达诱导block b的dna甲基化，导致col-0插入处chg和chh的甲基化增加 (图3b)。尽管对于表达ir靶向col-0插入区的植物，检测到ft表达没有统计学上的显著差异(图3c)，但检测到轻度但显著的后期开花表型(图3d)。

通过系统发育分析，通过分析更多十字花科物种的直系同源序列。位于ft下游1kb的600bp位置，命名为block e，在所有序列中高度保守(图3a)。除了系统发育外，block e和block c都位于极易接近的染色质上(图3a)。进一步的分析显示，block e和block c共享几个与潜在tfbss重叠的超保守区域，例如一个i盒、一个re-alpha盒和两个ccaat盒。此外，区块包含g盒( cacgtg)， chip-seq数据发现其与光敏色素相互作用因子4 (pif4)的结合峰。

研究者设计了一个ir来靶向block e，并测试dna甲基化积累是否会像block c一样影响开花时间(图3a)。与野生型相比，block e ir的表达统计上显著延迟了开花时间(图3e)。与开花时间的延迟一致，在表达针对block e的ir的转基因系中，ft表达减少(图3f)，这与所有序列dna甲基化的增加(图3b)相关。

为了研究两个远端调控区之间的遗传作用关系，研究者检测了irs block e和block c间f1杂交的开花时间，f1植株开花的时间明显晚于亲本。总的来说，这两个调控区域在调节开花时间方面起着加性作用(图3g)。

 

图3 、block e是位于ft下游的一个新的调控元件

 

block e和block c增强了ft启动子的光周期编码响应

考虑到block e和block c共有的tfbss数量，研究者检测了block e稳定转化报告基因株系中的顺式调节功能。之前报道表明，与block a融合的block c，而不是单独的block a，可以使叶片中gus的表达。block e正向和反向融合到ft区(block a)或nos启动子上。尽管block c显示仅当与block a融合时驱动gus表达，框block e能够用两种最小启动子驱动gus表达(图4a)。

为了评估阻断block e在对光周期的反应中是否调节了表达，实验比较了在短时间内连续生长的3周幼苗和2天转换到长时间后的幼苗之间的报告基因表达。我们只使用了反向方向的block e的结构植株，因为这些植株给出了最强的信号。通过对样品进行gus转录的qrt-pcr分析。结果显示在长时间条件下，包含与block a的融合的block c或block e有明显的诱导作用，而与minnos的融合没有反应(图4b)。

 

 

图4、在长日条件下block e驱动gus表达

 

昊技术：

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