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发稿时间：2019-02-25来源：天昊生物

文章题目

single-cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma, hepatology, if: 14.079, 2018年7月，doi: 10.1002/hep.29778.

研究背景

肝细胞癌（hcc）的异质性对于其治疗是个巨大的阻碍，然而在单细胞水平上揭示hcc瘤内异质性的报道还十分有限。肿瘤干细胞（cscs）在肿瘤异质性中扮演重要角色，同时助长了治疗抗性、肿瘤复发和转移。因此急需从肿瘤细胞群落、细胞层次结构和特定癌种的细胞多样性等角度去了解瘤内异质性。当前的研究策略多是基于bulk tissue（块状组织），这样的方法不足以很好地揭示肿瘤进化和细胞群落。然而单细胞测序技术是解决这一问题的完美方案！

技术路线

主要内容

1. 肝cscs表型和异质性验证

基于已经明确的hcc cscs细胞表面marker，首先利用免疫荧光染色和流式分析表征商业化的抗体鉴定不同csc亚群的能力，包括cd13, cd24, cd44, cd90, cd133, 和epcam（图1）。共聚焦成像显示huh1和huh7细胞系无论在单分子层（图1a）或球状（图1b）的状态下，csc亚群的异质性均比较显著。

图1 hcc细胞csc表面marker异质性表达

然后利用流式基于单个marker分选csc亚群，于96孔板培养评估其自我更新（self-renewal）的潜能。huh1中大约15%-20% marker阳性的csc（图2a），huh7中大约8%-12%可以分化（图2b），而低氧条件下（促进干性）只有特定的csc亚群能够分化（图2a, b）。然后对培养2周后的单个marker表达的细胞进行计数，发现在huh1和huh7细胞中不同csc亚群其自我更新能力差异巨大（图2c, d）。而与未分选的细胞相比，单个marker表达的细胞可以在不同程度上扩展形成混合的cscs群（图2e）。

图2 marker明确的csc功能分析

总体上这些结果能够说明利用单个细胞表面marker能够发现明显的csc亚群，它们具有高度的自我更新的能力。

2. 单个肝cscs转录组图谱及异质性

为了确定单个marker表达的csc中生物学差异是否与不同的分子特征相关，首先利用单细胞smart-seq技术对单细胞转录组进行表征，方法策略详见技术路线，分别对单个细胞、10个或100个细胞的pool进行分析，同时结合单细胞转录组测序的公共数据比较，包括人胚胎干细胞（hsec）、小鼠内皮细胞（mec）、小鼠造血干细胞（mhsc）。主成分分析发现，每种细胞类型有明显不同的转录组特征（图3a）。无论是hcc细胞系还是新鲜分离的肿瘤样本，每个细胞群下的单个细胞其转录组是不同的，但是这样的不同在10个或100个细胞的pool中会消失，这表明转录组的异质性确实在单细胞水平上存在，而在pool样本中显著降低（图3a）。单个huh7细胞基于marker表达聚类结果如图3b。

图3a-b 单细胞转录组揭示marker明确的csc异质性

如果单细胞中marker基因表达带来的转录组差异在功能上是重要的，那这些改变应当与hcc生存相关。因此基于3个marker阳性（triple ）和阴性（triple^-）（cd133/cd24/epcam）进行分类比较，其中286个基因与triple 相关。利用这286个基因特征进行预后分析，lci cohort肿瘤样本中log-rank和permutation分析triple 能够预测整体生存率，交叉验证的结果更显著（图3c）；而在非肿瘤样本中不存在这样的关系（图3d），这说明triple  marker特征是肿瘤特异性的。相似的结果在tcga cohort中也有发现（图3e）。

图3c-e 基于特征基因进行生存风险预测

对huh7细胞中基于单个marker分选的csc亚群分析发现基因表达重叠较少（图4a），网络分析显示与不同maker基因特征相关的top networks大部分也不能重叠（图4c-f）。而这些marker特征能够预测不同cohort的整体生存率（图4b）。

图4 marker明确的csc显著不同的分子信号及预后相关

3. 肝细胞群转录组图谱及异质性

为了确定整体细胞群的多样性，利用10x genomics gemcode技术对huh1, huh7和p1中的细胞进行单细胞转录组测序，共3847个单细胞以tsne可视化（图5），与明确的marker状态下单细胞测序数据一致，出现明显不同的细胞类型（图5a）。已知的csc marker基因，已知的hcc特异的基因以及干性相关/免疫细胞基因的表达特征如图5b-d，说明细胞间异质性存在。

图5 10x genomics单细胞转录组数据展示

结论

文章最后也讨论了研究的局限性：仅仅依据两种hcc细胞系和一个临床样本；数据的优化问题。而文章揭示的hcc中csc分子组成和异质性可能对于csc靶向治疗有重要作用，基于单细胞转录组数据评估csc异质性及预后的价值能对瘤内异质性、肿瘤进展和临床意义提供新的视角。

天昊生物具有多年基因组、转录组和表观组检测与分析经验，现推出的10x单细胞转录组测序可为您提供专业便捷的科研服务及个性化的单细胞信息挖掘，期待成为您单细胞测序分析的优质服务提供商！

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