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发稿时间：2018-09-30来源：天昊生物

 

目前的细菌群落研究方法有：磷脂脂肪酸分析技术、高通量测序技术等，而细菌定量法有：氯仿熏蒸生物量碳氮测定法、染色-荧光显微镜计数法、平板培养计数法、实时荧光定量pcr法等。目前微生态研究论文中常常同时使用以上多项技术，例如最常用的就是qpcr绝对定量检测细菌总拷贝数和常规微生物16s扩增子测序检测细菌菌群结构的联合使用了。实际上如何将细菌群落结构和细菌绝对定量有机结合起来从而同时获得细菌群落结构和细菌菌种绝对拷贝数是目前微生物研究领域的一个技术趋势，同时对微生态的分析工作具有重大意义，今天小编就向大家介绍微生态研究最常用的几项技术，其中既有目前市场上最常用的两项技术，又有一项我们天昊自主研发的“1 1大于2” 检测新技术，那下面就看看哪个才是适合不同微生态研究目的那个它。

number1

qpcr绝对定量检测

 

涉及技术：qpcr绝对定量

原理：

• 构建标准曲线，将已知拷贝数的标准品梯度进行稀释，一般可以10倍稀释5-7个梯度，进行qpcr检测， ct值与样品中起始模板拷贝数的对数呈线性反比关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线；
• 对样品进行目的基因（例如细菌16s rdna区/真菌its区）qpcr检测，根据标准曲线计算样品中物种的绝对拷贝数。

优点：

• 个性化强，针对目标菌种设计特异性引物进行绝对定量检测

局限性：

• 对引物特异性要求较高，引物优化难度较大（见下图）

 

number2

常规微生物16s扩增子测序

 

涉及技术： 基因组目的区域pcr 二代测序；

原理：通过对基因组目的区域（细菌16s rdna区/真菌its区）进行pcr扩增，将目标区域dna扩增富集后进行高通量二代测序，然后将得到的序列与特定数据库比对，确认物种，将16s rdna 序列相似性高于97% 的不同序列定义为一个otu，即每个otu对应于一个不同的 16s rdna 序列，然后通过计算某一otu分类单元的序列数占总序列数的比值来获得物种相对丰度数据。通过out聚类分析，就可以知道样品中的微生物结构组成和不同微生物的相对丰度。

优点：

• 高通量测序，大数据量、低花费
• 客观还原菌群结构及相对丰度比例

局限性：

• 只能进行物种相对定量检测，不能反映物种绝对丰度情况（见下图）

 

   

number3

微生物16s扩增子绝对定量测序

 

涉及技术：（样本基因组目的区域pcr spike-in standards目的区域pcr） 二代测序；

原理：该方法通过向样品dna中添加一定量spike-in standards人工合成序列，进行16s扩增子文库构建、测序，再根据spike-in standards的16s扩增子reads数及其绝对拷贝数绘制标准曲线，计算出样品中otu代表序列对应物种16s rrna基因绝对拷贝数。添加16s spike-in standards到样品模板中进行16s rrna基因扩增子高通量测序较好的解决了样本中微生物的绝对定量问题，同时也能得到样本中的物种组成信息。

优点：

•  三合一: 常规微生物16s扩增子测序 总细菌绝对定量 特定菌种绝对定量
•  解析样本中总细菌的绝对拷贝数
• 解析样本中绝大多数优势物种的绝对拷贝数
• 同时客观还原样本菌群结构

 

局限性：

• 测序数据量高于常规微生物16s扩增子测序，成本有所增加
•  目前阶段只适合常规样本检测，例如土壤样本和粪便样本

 

微生物16s扩增子绝对定量测序新检测模式发挥“细菌群落结构 细菌绝对定量”两种检测技术的各自优势，变‘两张皮’为‘一盘棋’，最大限度地便利了微生态研究者的便利。

 

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