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发稿时间：2018-08-03来源：天昊生物

摘要一览

由可变聚腺苷酸化（alternative polyadenylation，apa）引起的mrna 3’ utr变短（3’ us）是一种常见现象，它可以促进体内肿瘤生长。此前的假设普遍认为，这一过程通过顺式作用来逃脱由microrna介导的对原癌基因表达抑制。本研究却发现，3’ utr变短在被预测为肿瘤抑制基因的竞争内源性rnas (cernas)转录本中得到了惊人的富集。研究者基于3’ utr变短（mat3utr）的反式效应模型分析揭示了其在改变cerna表达中的重要作用。mat3utr预测了许多3’ utr变短的反式靶点，包括pten，它是一个关键肿瘤抑制基因，参与了9个3’ utr变短基因（包括eps15和nfia） cerna 的crosstalk。对3’ utr变短调节子基因nudt21敲降后，以mirna依赖的反式作用方式抑制了phf6和larp1抑癌基因的表达。综上所述，本研究结果表明，3’ utr变短能够通过干扰cerna的crosstalk以反式作用方式，抑制肿瘤抑癌基因，而不是诱导顺式作用的原癌基因导致肿瘤发生的。

发表期刊：nature genetics 发表时间：2018-5-21 影响因子：27.125

背景介绍及研究意义

在细胞增殖和转化过程中，普遍存在着apa引起的mrna3’ utr变短的发生。先前人们的假设认为，变短的3’ utr通过逃脱mirna介导的抑制而导致顺式中原癌基因的激活。本研究挑战了这一假设，并暗示了3’ us在肿瘤发生中的不同功能，本研究有助于深入揭示肿瘤的发生机理。

可变聚腺苷酸化示意图

图片来源：https://en.wikipedia.org/wiki/polyadenylation

研究方法

rna-seq、mirna-seq及cerna鉴定，rip，qrt-pcr等。

研究结果

图1、3’ us (3’ utr shortening)基因与癌基因没有强关联。a) tcga rna-seq数据显示ccnd1的3’ utr区在肿瘤(黄色)和正常样本(蓝色)之间没有明显变化。poly(a)-seq结果观察到类似的模式。b) 358例tcga肿瘤/正常样本中3’ us基因(红色)和所有基因(灰色)的δpdui值(上图)。负δpdui表示3’ us变短。下图显示了358个肿瘤/正常样本中ccnd1的δpdui值。可见， ccnd1 3’ utr发生显著变短的发生肿瘤的仅展非常小的部分( 358人中有8人；2.2 % )。c）前期研究鉴定的3’us基因和癌基因之间的重叠p值及比率。

图2、3’ utr变短干扰cernet（cerna global regulatory networks）。a）乳腺肿瘤和匹配的正常组织中随机选择100000转录本对时有显著的mirna结合位点重叠的pearson相关系数。b）乳腺肿瘤和正常cernets中cerna对的数量。括号中的数字为归一化的肿瘤和正常样本之间共享边数。c）eps15 (3’ us基因)和pten ( cerna partner )在68例雌激素受体阳性乳腺肿瘤和匹配正常样本上的基因表达。水平线代表pten的平均表达值，在肿瘤中出现下降(fdr = 2.1×10^-10 )。d）热图显示了68个erp肿瘤/正常对(列)中按照3’ us基因的数量排序显著的apa(alternative polyadenylation)事件(行)。venn图显示了正常和肿瘤cernet中cerna对的数量。括号中的数字为肿瘤和正常组织归一化后共享的边数。p值是根据单尾皮尔逊卡方检验计算结果。

图3、3’ utr变短抑制tcga乳腺癌中的肿瘤抑制基因表达。a）3’ us cerna hub基因(红色)、3’ us cerna non-hub基因(蓝色)、3’ us基因(紫色)和随机refseq基因(灰色)的功能富集结果。本研究随机抽样每个基因类别到相同的数量各100次；绘制了具有标准偏差的平均p值。b）3’ us cernas (n = 160，左框)抑癌基因的相对表达(肿瘤/正常)低于不在cernet中的抑癌基因( n = 226，右框)。c）3’ us基因(左)可能通过3’utr变短释放的mirnas (中间)通过反式作用抑制其cerna伴侣pten表达。d）上面热图显示了9个3’ us基因(行)的apa事件。下图显示了10种肿瘤中pten的表达水平，其中utr变短最多(左)或最少(右)。e）用对照(con.)或eps15靶向sirnas处理的mcf细胞裂解物的western blot分析。这幅图代表了三个独立的实验。f）为用含有pten 3’ utr和eps15靶向sirnas的荧光素酶报告基因转染的mcf7细胞裂解物的荧光素酶活性定量结果。g）pten 3’ utr荧光素酶报告基因在转染了eps15和dicer靶向sirnas的mcf7细胞中的活性。h）用含有载体衍生的3’ utr (con.)或eps 15 3’ utr以及gfp构建体的异源报告基因转染的mcf7细胞的间接免疫荧光。通过与alexa fluor - 594结合的抗pten抗体检测pten。箭头突出显示pten 转染的细胞。

图4、nudt21介导的3’ utr变短导致肿瘤抑制因子以反式作用被抑制。a) 在nudt21敲降(kd)实验中，癌基因或抑癌基因中3’ us cernas (红色)、3’ us 基因(蓝色)和refseq基因 (灰色)的富集情况。实验对每个基因类别随机抽取到相同的数量(n=1168) 100次，并得到标准偏差的平均p值。b）3’ us cernas ( n = 57，左框)或未与3’us基因关联( n = 339，右框)的抑癌基因的表达变化。3’us cerna抑癌基因在nudt21敲降样品中表达较低( p = 0.03 )。c）使用crispr / cas9在hela细胞中敲降nudt21的通过western blot检测。d）用ago2抗体进行rip实验，以正常小鼠igg作为对照。用western blot检测rip复合物。

图5、nudt21介导的3’ utr变短抑制肿瘤抑制基因phf6和larp1。a）nudt21敲降细胞3’ us cerna肿瘤抑制基因(phf6/larp1)和3’ us基因(lamc1/yod1)的western blot结果。b）在nudt21敲降细胞和对照sirna转染细胞中，phf6 3’ utr和larp1 3’ utr荧光素酶活性检测。c）nudt21敲降诱导yod1的3’ utr变短和表达上调，使得mir-3187-3p和mir-549抑制phf6。d），使用转染nudt21sirna (si-nudt21-4)的hela细胞裂解物和两种阻断mir-549和mir-3187-3p的拮抗剂的western blot分析。e) phf6 3’ utr荧光素酶报告载体在具有sirnas、mirnas或拮抗剂的hela细胞中的活性。f）用对照sirna或yod1 sirna转染的细胞裂解物的western blot分析。g）在用与f中相同的实验设计处理的细胞中phf6 3’ utr荧光素酶的活性。h）用sirnas转染的细胞中phf6荧光素酶的活性检测。

结论

1、通过对tcga数据库rna-seq等数据挖掘发现，3’ us基因与原癌基因不存在强关联现象。

2、cerna可以通过反式作用形成调控网络（cernet）来控制生物活动进程。本研究通过对tcga数据的分析发现3’ utr变短可以干扰cernet。

3、对tcga乳腺癌数据分析及功能验证实验表明，3’ utr变短抑制tcga乳腺癌中的肿瘤抑制基因的表达。

4、对3’ us关键因子nudt21的细胞敲降实验表明，nudt21介导了3’us cerna抑癌基因（如phf6和larp1）以反式作用被抑制。

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