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发稿时间：2018-08-01来源：天昊生物

南京师范大学地理科学学院近期在《applied soil ecology》上发表了西瓜种植可以重塑被还原性土壤消毒调节的土壤微生物群落结构的文章。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的扩增子测序工作。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：watermelon planting is capable to restructure the soil microbiome that regulated by reductive soil disinfestation

中文题目：西瓜种植可以重塑被还原性土壤消毒调节的土壤微生物群落结构

期刊名：applied soil ecology     

发表时间： 2018年5月    

影响因子：2.786

研究背景: 

众所周知，土壤微生物群落在保持土壤健康和抑制植物病害起着重要的作用，而植物也有能力通过释放各种各样的化合物来驱动和塑造微生物群落。此外，越来越多的研究表明，还原性土壤消毒（rsd）能显著地改变土壤微生物群落，然而，受rsd调节的土壤微生物群落对植物栽培的响应仍不清楚。因此，本文提出以下两个假设：1）rsd处理和对照组土壤中的微生物群落在植物根系分泌物影响下差异加剧；2）rsd处理和对照组土壤中的微生物群落在植物生长后趋于相似，因为某些根系分泌物能够选择一些相似的特定土壤微生物群。

研究对象：

本试验所用土壤收集自江苏省农业科学院，西瓜在该土壤中连续栽培多年，最终遭受严重枯萎病。在中国广西糖厂获得了有机物料糖发酵液（sf），用于rsd处理。在西瓜播种前，用rsd处理上述尖孢镰刀菌侵染土壤。简而言之，实验完全随机设计，重复三次，每个重复包含10盆，做以下处理：（1）ck，4kg土壤装入盆中，无需有机物改良剂、灌溉和密封；（2）rsd，4kg土壤掺入2%（v/w）有机物料糖发酵液（sf），装入盆中，灌溉土壤至饱和并用塑料膜密封。盆栽土壤在35°c下培养20天，在培养期内，ck土壤含水量保持在15%～18%，符合田间土壤水分状况。培养20天后，所有土壤自然排水，过8 mm筛并充分混合。将10盆土壤（每盆取30g土壤）合并成一个土壤样品，每个处理3个生物学重复。收集的土壤分别保存在4°c和-80°c下做进一步分析。

取样后，每千克土壤掺入1g（w/w）无机复合肥（n:p:k:16:16:16），然后将一株含有三个叶片的西瓜幼苗放入各盆，分别在30°c和15°c条件下培养90天。经过40天的生长后，每十天记录一次植物的病情指数和芽长，在栽培结束后调查根长和生物量。还用上述策略收集土壤样品（分别定义为ck-c和rsd-c）做进一步分析。

miseq测序：细菌测序区段（v4）；真菌测序区段（its1）

研究结果：

土壤ph值与微生物总活性

培养20天后，rsd处理组土壤ph值显著高于ck组。西瓜栽培后，ck和rsd处理组土壤ph值均下降（表1）。与ck对照相比，rsd处理组的总微生物活性显著提高了7.84μg g ⁻¹ h ⁻¹。西瓜栽培后， rsd-c组总微生物活性显著下降，但是与ck-c组没有明显差异。

表1  rsd处理和西瓜栽培后土壤ph值和微生物活性的变化。ck为未处理土壤，rsd为土壤施用2%（v/w）糖发酵液灌溉饱和后封闭，“-c”代表西瓜栽培后。

西瓜植株生物量、长度及病情指数

在40～90 d的栽培过程中，ck组的病情指数始终高于rsd处理组，rsd处理组的芽长比对照组高了37%～23.7%。栽培90 d后，rsd处理组芽和根的鲜生物量和植物长度分别比ck组提高47.67%、83.33%、23.67%和62.88%（表2），与对照组相比，rsd处理组病情指数显著降低。

表2  ck和rsd处理组西瓜植株生物量、长度和病害指数。

土壤细菌、真菌和尖孢镰刀菌

总体而言，与ck相比，rsd处理对细菌和真菌的种群大小没有显著影响。然而，rsd土壤中，尖孢镰刀菌的数量明显减少了99.22%（图1）。西瓜栽培后，在ck-c和rsd-c组中细菌数量均无显著增加，而真菌种群则分别增加了2.49倍和2.27倍（图1a、b）。rsd-c组土壤尖孢镰刀菌数显著增加，仍显著低于ck-c组（图1c）。

图1  rsd处理和西瓜栽培后土壤细菌（a）、真菌（b）、尖孢镰刀菌（c）丰度。

rsd处理对细菌/真菌的比例没有显著影响，然而在种植西瓜后，ck-c和rsd-c组中细菌/真菌的比例分别显著降低64.48%和59.29%（图2a）。相反，在rsd处理中，尖孢镰刀菌/真菌比例显著降低，即使在西瓜栽培后ck-c和rsd-c组中的尖孢镰刀菌/真菌比例都迅速恢复，这种趋势仍然存在（图2b）。

图2  rsd处理和西瓜栽培后细菌/真菌比例（a）和尖孢镰刀菌/真菌比例（b）。

土壤微生物群落α多样性

与对照相比， rsd处理后细菌的丰富度、真菌香农多样性和均匀度略有增加。西瓜栽培后，ck-c和rsd-c组的真菌丰富度和细菌多样性、均匀度均显著降低，而细菌丰富度在两个处理组中均无显著下降。除了rsd-c处理中真菌均匀度显著高于ck-c处理之外，其余的细菌和真菌α多样性在ck-c和rsd-c土壤之间没有显著差异。

土壤微生物群落结构与组成

pcoa显示，与ck处理相比，rsd处理显著地影响土壤细菌和真菌群落结构（图3a、b）。然而，在西瓜栽培（ck-c与rsd-c）之后，土壤细菌和真菌群落又发生了变化，并趋于相似，特别是对于细菌群落（图3a，b）。

图3  rsd处理和西瓜栽培后不同土壤微生物群落的pcoa分析、pca分析和冗余分析（rda）。基于bary curits距离（a，细菌，b，真菌）的pcoa分析。基于细菌（c）和真菌（d）优势菌群分布的pca分析。rda图显示了优势菌群（e，细菌，f，真菌）和环境因子之间的关系。◆

细菌和真菌门水平

•  与ck处理相比，在rsd组中，优势细菌门firmicutes, od1, acidobacteria, chlorobi以及优势真菌门的ciliophora显著增加，而细菌门actinobacteria, tm7, chloroflexi, gemmatimonadetes相对丰度在rsd组中显著增加（表3）。
• 西瓜种植后细菌群落和真菌群落组成均发生变化，ck-c和rsd-c土壤的差异缩小，多数优势类群的相对丰度趋于相似（图3c、d）。
• 此外，rsd-c土壤中bacteroidetes（细菌）和ascomycota（真菌）的相对丰度显著高于ck-c土壤，而tm7, acidobacteria, basidiomycota（真菌）则呈现相反的模式（表3）。
• 此外，rsd处理后firmicutes, od1, acidobacteria, chlorobi, ciliophora显著增加，并随西瓜生长显著减少，然而actinobacteria, tm7, gemmatimonadetes, ascomycota展现相反的模式：rsd处理后其丰度降低，并随着西瓜栽培而增加。

表3  rsd处理和西瓜栽培后丰度大于2%的优势菌门

细菌和真菌属水平

• 与ck处理相比，rsd处理组中细菌优势属uc-bacteroidales, flavisolibacter, ucignavibacteriaceae，gracilibacter以及真菌优势属peziza, uc-basidiomycota, ciliophora显著增加。在rsd处理中，细菌属uctm7-1, uc-cytophagaceae, uc-a4b, uc-cfb-26以及真菌属davidiella，uc-pezizomycetes的相对丰度显著降低（图4）。
• 细菌类群和真菌属组成的变化类似于门级的变化：西瓜种植后ck-c和rsd-c土壤微生物群落差异缩小，多数优势类群的相对丰度趋于相似。
•  此外，rsd-c土壤中uc-chitinophagaceae, arthrobotrys,ascobolus丰度显著高于ck-c土壤，而uc-tm7-1, uc-xanthomonadaceae, conocybe则呈相反趋势（图4）。
• 此外，在rsd处理中，上述显著增加的菌属随西瓜生长量的增加而显著降低，而细菌属uc-chitinophagaceae, uc-tm7-1, uc-xanthomonadaceae以及真菌属conocybe, arthrobotrys, davidiella, monosporascus均表现出相反的模式，在rsd处理后减少，在西瓜栽培后增加了超过百分之十（图4）。

图4  rsd处理和西瓜栽培后，所有样本都存在的top10细菌和top10真菌的相对丰度。

土壤优势属与环境因子的关系

rda分析（图3e，f）表明，在rsd处理组中，上述显著增加的细菌和真菌属与土壤ph值呈正相关，与疾病指数（di）和尖孢镰刀菌呈负相关。然而，细菌属uc-tm7-1，uc-xanthomonadaceae以及真菌属uc-stephanosporaceae, conocybe, arthrobotrys, and monosporascus与土壤ph呈负相关，与尖疾病指数（di）和尖孢镰刀菌呈显著正相关。

研究结论：

1. 结果表明，rsd处理能显著抑制尖孢镰刀菌与镰刀菌枯萎病，促进西瓜生长，提高微生物活性。

2. 然而，西瓜栽培后尖孢镰刀菌病原菌迅速恢复。虽然rsd处理能显著改变土壤微生物群落，但西瓜栽培也具有重塑和对照类似土壤微生物群落状态的能力。

3. 总体上，rsd处理能显著降低西瓜枯萎病的土壤传导性，西瓜播种后枯萎病土壤传导性迅速恢复。西瓜播种后尖孢镰刀菌和土壤微生物群落的变化可能归因于西瓜释放出的根系分泌物，它们有足够的强大动力通过筛选微生物库来选择相似的菌群。