研究背景：
微生物群落通过影响营养和免疫功能在婴儿发育早期起着重要作用，由于影响早期肠道微生物群组成的因素具有显著的预后和治疗意义，因此对于胎儿环境中微生物是否发生相互作用人们有着强烈的兴趣，如果是这样，那它们又是怎样影响母婴健康的？羊水历来被视为是无菌部位，在健康妊娠中，中期妊娠羊水培养基研究发现羊水是无菌的，或仅在13%的羊水样品中分离出细菌。然而，在妊娠并发症（例如早产、先兆子痫、小于胎龄、胎膜早破）羊水中可检测到细菌。最近使用二代测序在15个健康足月妊娠羊水样本中检测到的细菌序列，这表明羊水中含有微生物群落。健康足月羊水中检测到微生物种群意味着新生儿出生前微生物定植，以及微生物对婴儿健康发育的影响，在出生前就已经开始了。
同样，关于在子宫内环境的其它组分中是否存在细菌种群也有争论，包括胎盘、脐带血和胎粪。目前细菌从21-26%健康足月分娩的胎盘中已被分离培养出来，另外从健康新生儿脐血中也分离出活菌（肠球菌、链球菌、葡萄球菌或丙酸杆菌）。随着二代测序技术的出现，细菌序列也从足月妊娠的胎盘和胎粪中被检测到。然而，最近的一项研究发现，足月胎盘的细菌菌群类似于污染和实验对照的细菌菌群。此外，由于许多无菌动物可以通过无菌剖宫产可靠地获得，因此推断健康妊娠的宫内环境是无菌的。
人们对胎儿环境中的病毒也知之甚少，特定的致病性病毒如巨细胞病毒（cmv）、hiv、肠道病毒、流感、风疹、水痘、寨卡和hpv肯定是通过胎盘或生殖道传播给胎儿的。通过靶向pcr、cmv、腺病毒、单纯疱疹病毒、人疱疹病毒6、肠道病毒、eb病毒、呼吸道合胞病毒和人细小病毒b19，可以在羊膜穿刺遗传筛查获得的羊水中鉴定到。此外，早产儿的早期大便检测到既有真核病毒也有噬菌体。然而，没有研究使用无偏的方法来确定羊水中是否存在病毒。
在这里，我们使用基于序列的方法检测足月妊娠羊水中是否存在细菌群落或病毒群落（真核病毒和噬菌体），这将对我们了解婴儿肠道最初是如何被微生物感染有重要的影响。
研究设计：
研究结果：
羊水含有较低的细菌生物量
我们评估了在剖宫产中获得的24例无并发症足月妊娠的羊水标本。产妇年龄中位数为28岁，出生时婴儿体重中位数为3288 g。为了定量羊水样本中的细菌生物量，使用qpcr检测了16s rrna基因拷贝数。羊水样品中的16s rrna基因拷贝数为944 copies/ml (sd 374)，与儿童粪便样本16s rrna基因拷贝数3.92 ×108 copies/g (sd 3.84 ×108 )相比，细菌生物量非常低（图1）。因为担心这些低密度序列是污染，因此在阴性对照（试剂阴性对照：dna-free water；提取阴性对照：extraction buffer）中寻找16s rrna基因拷贝，水阴性对照的平均16s rrna基因拷贝数为93个拷贝/ml（sd 40），缓冲液提取阴性对照的平均16s rrna基因拷贝数为1062个拷贝/ml（sd 390）。尽管羊水16s rrna基因拷贝数高于水阴性对照组，羊水和缓冲液提取阴性对照组之间的16s rrna基因拷贝数无统计学差异。实际上，与先前的研究一致，羊水的16s rrna基因拷贝数与提取阴性对照没有区别。
图1 在羊水样品、水（试剂阴性对照）、缓冲液（提取阴性对照）和儿科粪便样品中16s rrna基因拷贝绝对定量。统计学意义通过mann whitney检验进行评价，**p≤0.01, ***p≤0.0001. ns, non-significant
羊水细菌特征与对照不可区分
接下来，我们考虑羊水中含有一组与实试剂对照不同的细菌。因此，我们对羊水、水（试剂阴性对照）、缓冲液（提取阴性对照）和儿科粪便样品（阳性对照）进行了16s rrna扩增子测序。我们发现羊水标本的细菌丰富度和缓冲液提取阴性对照之间没有统计学上的显著差异，羊水细菌丰富度高于水阴性对照组，但低于粪便对照组（图2a）。为了比较羊水标本和对照组之间的细菌群落结构，进行了pcoa分析，羊水标本与缓冲液提取阴性对照重叠，但不同于粪便（阳性对照）和水阴性对照（图2b）。虽然与其它粪便样品相比，粪便细菌菌群与缓冲液对照差异显著（图2c，右），但我们检测到羊水细菌菌群和缓冲液对照之间没有显著差异（图2c，左）。
图2 a每个样品类型的细菌丰富度（细菌otus数目）；b pcoa分析；c样本类型内部或者样本类型和缓冲液对照之间的bray curtis相异性分析。
接着我们试图确定在羊水中存在，但是缓冲液和水阴性对照中不存在的细菌otus，我们发现对只存在于羊水中的细菌otus占很少的相对丰度（图2d）。重要的是，这些罕见的细菌otus没有频繁地在其他羊水标本中检测到。
图2 d 只存在于羊水中的细菌otus相对丰度
羊水中很少检测到病毒
新兴的“羊膜内微生物群”假说提出羊水也可能含有一个病毒群落。因此，我们调查了这些羊水标本的病毒。为了全面检测dna和rna病毒，从羊水样品中提取的总核酸经过与序列无关的dna和rna扩增（sia），同样在这些实验中包括水阴性对照和缓冲提取阴性对照。只有一个羊水样本检测到了真核病毒--gb病毒c（10号标本, 12条病毒测序序列）。因为我们只鉴定了一个rna病毒，然后我们使用多重置换扩增(mda)来检测，这种方法仅识别dna病毒，并且通常比sia方法更敏感。羊水中平均病毒测序数为331个（sd 248），相比之下，粪便标本平均获得34027个病毒测序数（sd 44667）（图3a）。羊水样品的病毒丰度小于缓冲液提取阴性对照、水阴性对照和粪便样品（图3b）。羊水中检测到的大多数病毒可归因于提取阴性对照和/或水阴性对照（图3c）。
图3 a 不同样本类型的病毒测序序列数目；b不同样本类型的病毒丰富度；c 分配给不同样本类型的不同病毒种类的热图。
接下来我们试图确定仅在羊水标本中，但不存在于对照组的病毒。我们发现，一个羊水标本（标本5）有一个噬菌体的106条测序序列，这个噬菌体最类似于气单胞菌噬菌体44 rr2.8t。然而，大多数其它羊水标本没有“羊水特异存在的”病毒序列（图3d）。
图3 d只存在于羊水中的病毒丰度
为了评估pcr抑制剂是否可能存在于羊水标本中，我们进行了一项spike-in实验。在羊水样品中加入1.8×107拷贝含有部分腺病毒六邻体基因的质粒，然后进行总核酸提取。定量pcr检测靶向核酸，检测到3.3×106拷贝（图3e），表明羊水中病毒的缺乏不是由于pcr抑制剂造成的。
图3 e羊水样品和spike-in样品（点线）中的腺病毒质粒数量
研究结论：
我们用二代测序方法对24例无并发症的足月妊娠羊水进行了病毒和细菌进行了鉴定。与预期相反，羊水中的细菌菌群与阴性对照是无法区分的。羊水中病毒的序列很少，没有发现样本间存在有共有核心病毒的证据。
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