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发稿时间：2018-04-12来源：天昊生物

继天昊methyltarget^®多重目的区域甲基化富集测序技术动物领域首发文章后，南京农业大学动物健康与食品安全国际合作联合实验室利用methyltarget^®技术近期又在《comparative biochemistry and physiology》杂志上发表了母鸡补充甜菜碱通过dna甲基化修饰来调控f1代公鸡下丘脑胆固醇代谢相关基因表达的文章。在恭喜客户又发表文章同时，我们再跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：dietary betaine supplementation in hens modulates hypothalamic expression of cholesterol metabolic genes in f1 cockerels through modification of dna methylation

中文题目：母鸡补充甜菜碱可以通过dna甲基化修饰来调控f1代公鸡下丘脑胆固醇代谢相关基因的表达

期刊名：comparative biochemistry and physiology, part b     影响因子： 1.757

技术：methyltarget^®多重目的区域甲基化富集测序技术

实验描述如皋黄羽蛋鸡随机分为基础饲料组和补充甜菜碱(0.5%)喂养组，喂养30天后，收集鸡蛋进行孵化，孵化的小鸡相同条件下生长56天，然后进行称重和取样。取颈静脉至肝素抗凝管，3000×g离心，4°c 10分钟制备血浆。解剖下丘脑，迅速在液氮中冷冻，然后储存在−70°c作进一步分析。

研究目的: 

甜菜碱广泛应用于动物营养，作为蛋氨酸代谢中的甲基供体可通过基因表达调控实现营养重编程。目前不清楚蛋鸡喂养添加甜菜碱的饮食是否会影响f1代下丘脑的胆固醇代谢。

研究结果：

血浆和下丘脑胆固醇含量

母鸡补充甜菜碱并没有改变体重，但是f1公鸡血浆总胆固醇和高密度脂蛋白（hdl-c）浓度显著增加，此外，母鸡喂养甜菜碱可显著增加f1公鸡下丘脑总胆固醇和胆固醇酯含量（表3）。

表2  体重；血浆中总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量；下丘脑中总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量。tch：总胆固醇；hdl-c：高密度脂蛋白胆固醇；ldl-c：低密度脂蛋白；bw, 体重； free cho：游离胆固醇；cho ester：胆固醇酯。

下丘脑胆固醇代谢基因的表达

母体喂养甜菜碱显著上调下丘脑srebp1, srebp2, ldlr 转录水平（图1a）和蛋白水平（图1b）。在甜菜碱组hmgcr mrna水平增加，而cyp46a1 mrna水平下降。此外，在甜菜碱组acat1和apo-a1 mrna水平均明显升高。

图1 母体补充甜菜碱对f1代下丘脑胆固醇代谢基因表达的影响。a.下丘脑中srebp1, srebp2, hmgcr, cyp46a1, acat1, apo-a, ldlr mrna水平。b. srebp1, srebp2, ldlr蛋白水平。

下丘脑甲基转移和神经肽相关基因的表达

母体喂养甜菜碱可在转录（图2a）和蛋白水平（图2b）上使bhmt和dnmt1表达明显增加。此外，与对照组相比，甜菜碱组中下丘脑bdnf和crh mrna水平表达显著下调，而npy mrna表达显著上调（图2c）。

图2  补充甜菜碱对f1代下丘脑甲基转移和神经肽相关基因表达的影响。a.下丘脑bhmt, dnmt1,dnmt3a mrna表达水平。b. 下丘脑bhmt, dnmt1,dnmt3a 蛋白表达水平。c. bdnf, npy, crh mrna表达水平。

下丘脑srebp1, srebp2, apo-a1等基因启动子cpg甲基化

对下丘脑基因组dna进行了methyltarget^®技术分析（mean coverage of> 600×），结果发现srebp1, srebp2, apo-a1等基因启动子区cpg岛甲基化状态受母体喂养甜菜碱调节。srebp1(−1350 to −1199), srebp2 (−2030 to −1612), apo-a1 (−725 to −505)等基因的近端启动子区被用于甲基化分析（图3）。srebp1启动子区段包括包含11个cpg位点，这些cpg位点在甜菜碱组相对于对照组都是低甲基化。srebp2启动子区段包括包含4个cpg位点，其中3个cpg位点在甜菜碱组相对于对照组是低甲基化的， 另外1个cpg位点则是在甜菜碱组高甲基化。apo-a1启动子区段包括包含5个cpg位点，这些cpg位点在甜菜碱组相对于对照组都是低甲基化。总的来说，srebp1, srebp2, apo-a1所检测的3个片段平均甲基化程度在甜菜碱组明显降低，这与它们的mrna丰度呈负相关。

图3  f1代下丘脑srebp1,srebp2,apo-a1基因启动子甲基化状态。 srebp1 (−1350–−1199), srebp2 (−2030–−1612)和apo-a1 (−727–−505) 5’侧翼启动子序列示意图。srebp1, srebp2, 和apo-a1 启动子区域平均甲基化状态（左图）和差异甲基化cpg位点（右图）。

总结：◆

•  甜菜碱组血浆总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇含量显著升高，下丘脑中总胆固醇和胆固醇酯含量也显著升高。
• 相应的，下丘脑srebp2, hmgcr, ldlr, srebp1, acat1，apo-a1等基因表达显著上调，cyp46a1表达上调，这些变化与bdnf和crh表达显著下调以及npy表达显著上调有关。
• 此外，参与甲基转移循环的基因也被调控，例如dnmt1和bhmt的mrna和蛋白水平都显著上调，这与srebp-1, srebp-2，apo-a1等基因的启动子cpg甲基化明显修饰相关。
• 这些结果表明，蛋鸡喂养甜菜碱可以通过启动子dna甲基化修饰来调控f1代公鸡下丘中参与胆固醇代谢和脑功能相关基因的表达。

天昊创新性methyltarget^®多重目的区域甲基化富集测序技术：

• 性价比高：传统克隆测序一个片段10个克隆的价格，methyltarget可以完成约60个片段的检测（检测深度为1000x，相当于1000个克隆）
• 精确度高：基于二代测序数据检测甲基化程度，精确到单碱基分辨率，与基于测序的全基因组甲基化测序，rrbs数据有高度一致性
• 精确定量：测序深度高达1000x，并可以进一步加深，相比于传统克隆测序，可以对位点甲基化程度进行准确定量
• 技术灵活：基于多重pcr富集进行目标区域富集，可随时进行基因和位点的变化和改动，并且可以获得每个片段的甲基化单倍型