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发稿时间：2018-04-12来源：天昊生物

南京农业大学动物生理生化重点实验室近期在《poultry science》上发表了补充甜菜碱促进蛋鸡类固醇激素合成急性调节蛋白和卵黄沉积肾上腺皮质酮表达的文章。在这项研究中使用了天昊生物创新性的高通量高灵敏度甲基化水平检测技术methyltarget^®。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：dietary betaine supplementation increases adrenal expression of steroidogenic acute regulatory protein and yolk deposition of corticosterone in laying hens

中文题目：补充甜菜碱促进蛋鸡类固醇激素合成急性调节蛋白和卵黄沉积肾上腺皮质酮的表达

期刊名：poultry science       影响因子： 1.908

技术：高通量高灵敏度甲基化水平检测技术methyltarget^®

实验描述

如皋黄羽蛋鸡在38周龄分为对照组和甜菜碱组，每组60只母鸡，每组20个笼子（每笼3只母鸡）。分别饲喂基础日粮和甜菜碱添加日粮，共4周。记录初始体重、产蛋性能和蛋品质参数。在饮食治疗结束后，每组取12只体重正常的母鸡进行采样和进一步分析。解剖肾上腺，液氮快速冷冻，保存在−80◦c做进一步分析。收集最后一天饮食处理的鸡蛋，每组随机抽取12个鸡蛋，蛋黄被分离、均质和冷冻保存在−80◦c直到提取皮质和总胆固醇测定。抽取血液样本，分离血浆和存储在−20◦c。

研究目的: 

甜菜碱（betaine）是一种重要的甲基供体，通过基因表达的表观遗传调控实现营养重编程实现。本研究探讨了甜菜碱对蛋鸡的饲喂是否会影响肾上腺皮质糖皮质激素合成和卵子中皮质酮的沉积，以及是否与甲基转移酶的表达及受影响基因的启动子甲基化状态有关。

图1 蛋氨酸循环示意图。 bhmt：甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶；mat2b: 腺苷蛋氨酸；sam: s-腺苷甲硫氨酸； dnmts：dna甲基转移酶； gnmt：甘氨酸n-甲基转移酶；ahcyl1:腺苷高半胱氨酸酶1；star: 类固醇激素合成急性调节蛋白；sf-1：类固醇生成因子-1

研究结果：

产蛋性能

甜菜碱对体重和蛋品质参数没有显著影响，如蛋重、蛋黄重、蛋长和蛋壳强度（表2）。甜菜碱处理组平均产蛋率显著高于对照组（p＜0.05）（表2）。

表2  蛋鸡体重和蛋参数的研究

血浆生化参数

如表3所示，甜菜碱处理组的总胆固醇和甘油三酯浓度显著高于对照组。此外，膳食甜菜碱补充显著增加低密度脂蛋白胆固醇（ldl-c）和丙氨酸氨基转移酶（alt），而总蛋白（tp）、葡萄糖（glu）、丙氨酸氨基转移酶（ast）、高密度脂蛋白胆固醇（hdl-c）不受影响。

表3  血浆生化参数

鸡蛋皮质酮和肾上腺中胆固醇含量

蛋鸡喂养甜菜碱显著升高蛋黄皮质酮含量（图2a），而不改变血浆皮质酮（图2b）和鸡蛋总胆固醇含量（图2c）。甜菜碱处理的鸡体内总胆固醇含量显著下降（图2d）。

图2  a）鸡蛋cort浓度；b）血浆cort浓度；c）鸡蛋总胆固醇含量；d）肾上腺总胆固醇含量。

肾上腺类固醇相关基因的表达

蛋鸡饲粮添加甜菜碱显著上调肾上腺star（类固醇激素合成急性调节蛋白）, 其转录因子sf-1（类固醇生成因子-1）以及gr（糖皮质激素受体）mrna的表达（图3a）。

图3 甜菜碱对肾上腺参与类固醇激素合成和甲基转移基因表达的影响。a）肾上腺类固醇激素合成基因mrna表达； 

肾上腺蛋氨酸代谢基因的表达

与对照组相比，甜菜碱组中，蛋氨酸代谢基因（ahcyl, dnmt1, dnmt3a）mrna的丰度显著上调，bhmt（甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶）、甲硫氨酸腺苷基转移酶（mat2b）和甘氨酸n-甲基转移酶（gnmt1）则保持不变（图3b）。

图3 甜菜碱对肾上腺参与类固醇激素合成和甲基转移基因表达的影响。b）肾上腺bhmt, mat2b, ahcyl1, dnmt1, dnmt3a mrna表达。

star和sf-1基因启动子的cpg甲基化

对肾上腺基因组dna进行了methyltarget^®技术分析，对于star基因启动子，cpg岛的片段2包含16个cpg位点（−2,554 to −2,290），而片段1包含12个cpg位点（−2,318 to −2,087）（图4a）。star基因启动子片段1（图4b）和片段2（图4c）具有5种高频率的甲基化单倍型，片段1（图4d）和片段2（图4e）对照组和甜菜碱组之间的单倍型频率差异如图所示：片段1中的单倍型3和4，片段2的单倍型1和5的频率在甜菜碱组显著低于对照组，而片段2的单倍型3在甜菜碱组显著高于对照组。这2个片段上数个cpg位点的甲基化程度在甜菜碱和对照组有差异，但差异程度不一致，有些cpg位点在甜菜碱组相对于对照组是低甲基化，而有些cpg位点则是高甲基化（片段1：图4f；片段2：图4g）。

图4 肾上腺star基因启动子甲基化状态。a) 鸡star基因启动子序列示意图。b) star基因片段1不同甲基化单倍型示意图。c) star基因区段2不同甲基化单倍型示意图。d) star基因启动子片段1甲基化单倍型百分比。e) star基因启动子片段2甲基化单倍型百分比。f)对照组和甜菜碱组片段1cpg位点甲基化程度差异。g)对照组和甜菜碱组片段2cpg位点甲基化程度差异。

对于sf-1基因启动子，只对1个片段进行了分析（图5a），这个片段包含21个cpg位点（−3,935 to −3,699）。sf-1基因启动子的前5个高频率甲基化单倍型如图5b所示。对照组和甜菜碱组之间的单倍型频率差异如图5c所示, 单倍型2, 4和5的频率在甜菜碱组中显著低于对照组。sf-1基因启动子的21个cpg位点有14个cpg位点在甜菜碱组中是低甲基化的。

图5 肾上腺sf-1基因启动子甲基化状态。a) 鸡sf-1基因启动子序列示意图。b) sf-1基因不同甲基化单倍型示意图。c) sf-1基因启动子片段1甲基化单倍型百分比。d)对照组和甜菜碱组cpg位点甲基化程度差异。

总结：

• 补充甜菜碱能显著增加平均产蛋率，而体重和蛋品质保持不变。
• 在甜菜碱组，血浆胆固醇和低密度脂蛋白浓度也较高。
• 甜菜碱组鸡蛋蛋黄中的皮质酮较高，这与肾上腺类固醇合成基因的表达上调有关。
• 类固醇激素合成急性调节蛋白（star），连同其转录因子类固醇生成因子（sf-1）和糖皮质激素受体被显著激活。
• 补充甜菜碱能显著上调腺苷同型半胱氨酸酶1，dna甲基转移酶1（dnmt1）和dna甲基转移酶3a（dnmt3a）的肾上腺mrna表达。
• 亚硫酸氢盐测序分析显示肾上腺sf-1基因启动子区的数个cpg位点具有显著的低甲基化。
•  这些结果表明，蛋鸡补充甜菜碱可以激活star肾上腺表达，可能是通过sf-1基因的表观遗传调控达到的。

天昊创新性高通量高灵敏度甲基化水平检测技术methyltarget^®：

• 性价比高：传统克隆测序一个片段10个克隆的价格，methyltarget可以完成约60个片段的检测（检测深度为1000x，相当于1000个克隆）
• 精确度高：基于二代测序数据检测甲基化程度，精确到单碱基分辨率，与基于测序的全基因组甲基化测序，rrbs数据有高度一致性
• 精确定量：测序深度高达1000x，并可以进一步加深，相比于传统克隆测序，可以对位点甲基化程度进行准确定量
• 技术灵活：基于多重pcr富集进行目标区域富集，可随时进行基因和位点的变化和改动，并且可以获得每个片段的甲基化单倍型