南京农业大学凌宁教授课题组关于氮处理后丛枝菌根真菌（amf）和固氮菌（nifh）多样性和群落结构对小麦产量综合影响的研究在《agriculture, ecosystems and environment》期刊上发表。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的扩增子测序工作。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。
英文题目：n-fertilizer-driven association between the arbuscular mycorrhizal fungal community and diazotrophic community impacts wheat yield
期刊名：agriculture, ecosystems and environment
影响因子：4.099
研究背景:
氮是一种营养元素，在陆地生态系统净初级产量中起着很重要的作用，了解氮添加如何对地上部和地下生物产生影响是至关重要的。丛枝菌根真菌（amf）和固氮菌（nifh）都能够帮助植物获取氮，丛枝菌根菌和固氮菌的相互作用在土壤氮循环中也可能起着重要的调节作用。然而，在农田生态系统中添加氮后，这这两种土壤功能微生物发生什么变化以及它们之间如何相互作用目前还不清楚。
研究目的:
1） 用来调查氮素梯度施加过程中丛枝菌根真菌（amf）和固氮菌（nifh）微生物多样性和群落结构的变化。
2） 了解丛枝菌根真菌（amf）和固氮菌（nifh）这两种土壤功能微生物如何相互作用来影响小麦的产量。
研究对象：
实验田每年实行冬小麦-夏水稻轮作，在2010年开始实验，包括5个不同浓度氮处理：0、50、100、200、300 kg n ha −1，定义为n0、n50、n100、n200和n300。每个氮处理应用于3块地（每块地=10×4米）作为3个生物学重复。土壤样品在2015年5月收获小麦时获取。在每块地0～20 cm土壤耕层中随机采集6份土壤样品，每块地所有的土壤样品通过2毫米网筛去除根等杂物，彻底混匀，然后分为三份：第一份样本保存在4°c，用于土壤水分，溶解有机碳（doc），铵（nh 4 ），硝态氮（no 3−），土壤微生物生物量碳（mbc）和土壤微生物生物量氮（mbn）检测；第二份样本经过空气干燥，用于土壤有机碳（soc）、总氮（tn）和ph值测量；第三份样本保存在-80°c，用于分子分析。
测序技术：amf扩增子测序（amv4.5nf/amdgr），共获得1,030,007条优化序列; nifh扩增子测序（polf/ polr），共获得417,897条优化序列
数据库：maarjam（amf）；fungene（nifh）
研究结果：
不同氮肥处理对土壤理化性质及微生物量的影响
土壤ph值在不同氮肥处理样本间略有差异。硝态氮（no 3−）和溶解有机碳（doc）随着氮肥浓度增加而增加。铵（nh 4 ），土壤微生物生物量碳（mbc）和土壤微生物生物量氮（mbn）则随着氮肥浓度增加而降低。mbc和mbn在低氮浓度处理时（n0，n50）较高（表1）。
表1：不同施氮处理样本中土壤理化性质和微生物生物量碳（mbc）和氮（mbn）含量
不同施氮处理组丛枝菌根真菌（amf）和固氮菌（nifh）多样性的响应
丛枝菌根真菌（amf）的chao1指数和系统发育多样性随着氮肥浓度增加而显著降低，在n200处理组显著较少（图1）。固氮菌（nifh）的系统发育多样性随着氮肥浓度增加而显著增加，而chao1指数在不同浓度氮处理组没有显著差异。
图1 不同施氮处理组丛枝菌根真菌（amf）和固氮菌（nifh）的chao1指数（a, b）和系统发育多样性（c, d）
不同施氮处理组丛枝菌根真菌（amf）和固氮菌（nifh）群落结构的响应
pca分析显示丛枝菌根真菌（amf）和固氮菌（nifh）菌落结构根据不同浓度施氮处理而明显分开（图2a和b）。mantel检验显示氮浓度显著影响丛枝菌根真菌（amf）和固氮菌（nifh）群落结构(图2c)。有趣的是：不同施氮处理后amf的群落结构与nifh的群落结构非常相似 (图2c)。通过pca分析，低氮处理（n0和n50）下，amf和nifh群落结构高度相似，高氮处理（n200和n300）也得到类似的结果，因此把样本分为两组：低氮处理（n0和n50）和高氮处理（n200和n300），用于后续的网络分析。
图2 不同施氮处理组丛枝菌根真菌（amf）（a）和固氮菌（nifh）（b）群落结构pca分析，amf和nifh群落结构与不同氮肥处理浓度之间的mantel检验（c）
rda分析揭示了土壤理化性质与amf（图3a）和nifh（图3b）群落结构之间的关系。其中，土壤微生物生物量碳（mbc）与amf和nifh群落结构都显著相关。另外土壤微生物生物量氮（mbn）和硝态氮（no 3−）与amf群落结构显著相关。而溶解有机碳（doc）只与nifh群落结构显著相关。
图3 土壤理化性质与amf（图3a）和nifh（图3b）群落结构之间的rda分析
低氮和高氮处理组amf和nifh群落之间的 co-occurrence
基于上述结果，把样本分为两组：低氮处理和高氮处理，用于网络分析。网络分析结果表明，低氮处理与高氮处理有显著差异（图4）。在低氮处理中，网络有147个节点和187个边缘，有17个模块。对于高氮处理，网络有142个节点和191个边缘，有20个模块。定义有七个以上边缘的节点为网络中心，在低氮和高氮处理组分别有16个和23个的活性网络中心，在低氮网络中发现了3个amf物种和13个nifh菌种，在高氮网络中发现了2个amf物种和21个nifh菌种。
图4 基于spearman相关性的低氮和高氮处理组网络分析。不同的颜色边缘属于不同的模块。绿色节点显示属于nifh的otus。黄色节点显示属于amf的otus。
低氮处理组的amf网络中心数量多于高氮处理组，只有一个节点（amf-3）是两组所共有的。此外，虽然低氮处理组的amf网络中心数量多于高氮处理组，但是所有amf网络中心分类学上属于同一个科，在属水平，amf-3和amf-11属于diversispora，amf-15和amf-17属于glomus（球囊霉属）（图5a）。
图5a 活性amf otus系统发育树。
与amf相反，低氮处理组的nifh网络中心数量少于高氮处理组（图4），在门水平，低氮处理组有11个活性nifh网络中心，属于verrucomicrobia（疣微菌门）, proteobacteria（变形菌门），spirochaetes（螺旋体门）。高氮处理组有21个活性nifh网络中心，属于verrucomicrobia, proteobacteria, spirochaetes, chloroflexi（绿弯菌门）。两个节点，nifh-39 和nifh-68是两组所共有的，分别属于bradyrhizobium（根瘤菌属）和treponema（密螺旋体属）（图5b）。
图5b 活性nifh otus系统发育树。
土壤-微生物-植物系统的综合响应
采用结构方程模型（sem）研究整个土壤-微生物-植物系统的综合反应，从而揭示在氮处理后土壤，amf菌，nifh菌，以及植物全面详尽的反应。
氮处理对amf多样性(λ = −0.99)和群落结构(λ = 0.79)有明显的直接效果。另外，氮处理对硝态氮（no 3−）含量最初有明显的直接效果(λ = 0.57)，接着通过增加硝态氮（no 3−）含量间接影响amf多样性(λ = 0.77)和群落结构(λ = −0.49)。然而，氮处理仅仅能显著影响nifh多样性（λ= 0.43），对nifh群落结构并没有显著直接影响(λ = 0.16)，然而，nifh群落结构是由氮处理间接调节，由cue: nue ratio直接调节（−λ= 0.37）。此外，amf多样性与nifh多样性显著相关，amf群落结构与nifh群落结构也显著相关。
最后，小麦产量受氮处理（λ= 0.96）和amf群落结构（−λ= 0.60）显著而直接的影响。虽然amf多样性，nifh多样性和nifh群落结构对小麦产量没有显著的直接影响，但是它们可以通过与amf群落结构的交互作用间接影响小麦产量。此外，硝态氮（no 3−）和cue: nue ratio可以通过直接调节amf群落结构来间接影响小麦产量。
研究总结：
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