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发稿时间：2017-12-29来源：天昊生物

副标题：applied soil ecology：不同种植时间水稻土壤微生物群落的演替模式

 

中国科学院南京土壤研究所近期在《applied soil ecology》上发表了微生物群落随中国亚热带水稻种植过程中土壤肥力的增加而发生变化的文章。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的扩增子测序工作。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：shifts in microbial communities with increasing soil fertility across a chronosequence of paddy cultivation in subtropical china

中文题目：微生物群落随着中国亚热带水稻种植进程中土壤肥力的增加而发生变化

期刊名：applied soil ecology       发表时间： 2017年    影响因子：2.786

研究背景: 

水稻土是人为的土壤，它是粮食生产的主要来源。在水稻耕作过程中，土壤肥力演变是指土壤向作物提供养分能力的变化。土壤肥力主要受植物和微生物的调控，反过来土壤性质是微生物群落形成的主要因素。然而，在水稻土壤发育过程中养分积累与微生物群落演替之间的关系很难理清。影响微生物群落演替的因素很多，包括土壤养分、土壤类型、植被覆盖度和管理。目前对长期种植水稻土壤中控制微生物群落演替动态的主要影响因素尚不清楚。不同的土壤类型微生物群落演替的机制可能不一致。因此，非常有必要充分了解在特定土壤类型中土壤肥力的演变规律，从而为水稻栽培提供指导。在中国亚热带，第四纪红色粘土稻田土壤养分普遍不足，因此常常通过施肥来增加肥力。大多数研究报告了随着水稻栽培时间的延长土壤养分累积的作用，但只有少数评估了随着时间变化微生物群落的演替模式。

研究目的: 

了解微生物群落的聚集和演替是揭示土壤肥力发展机制的关键。因此本文的目的是调查随着中国亚热带水稻种植过程中土壤肥力增加微生物群落的演替模式。

研究假设: 

假设土壤养分是随着时间推移形成水稻微生物群落变化的主要因素，预计寡营养细菌类型将支配演替的最初阶段（0-15年），并在后面的演替阶段（30-100年）逐渐被营养丰富型细菌所替代，并伴随着土壤有机质含量（som）的提高。

研究对象：

共15个样本：不同使用时间稻田（中国亚热带分别使用5、15、30、100年的水稻栽培土）和其相邻贫瘠土地（使用0年），每个组别随机选取三个田间小区，在每个田间小区随机收集5个表层土壤（0-20厘米）样本，去除根碎片后，每个样本通过干冰运送到实验室，每个样品一部分经冷冻干燥存放在−80°c 用于plfa和高通量测序分析，一部分保存在4°c用于酶活性和微生物量分析，室温晾干的样本则用于化学分析测定（ph、有机碳、全氮、速效氮、全磷、速效磷、全钾和速效钾）。

研究思路：

• 用养分含量对土壤肥力条件进行量化：碳（c）、氮（n）、磷（p）和钾（k）。
• 磷脂脂肪酸（plfa）分析：用来评估随着时间推移水稻土壤微生物群落的演替。
• 16s扩增子测序：用来评估随着时间推移水稻土壤微生物群落的演替。
• 酶活性分析：β-木糖苷酶（βx），β-葡萄糖苷酶（βg）、n-乙酰氨基葡萄糖苷酶（nag）、酸性磷酸酶（ap）用来反映土壤有机质分解的潜力。

测序技术：16s rrna扩增子测序（v4-v5），每个样本获得35680-84808个序列（平均每个样本获得54306条序列）

研究结果：

水稻土壤化学性质随土壤使用时间而变化

与贫瘠土壤相比，水稻土壤化学性质增加。与贫瘠土壤相比，使用了5年的水稻土壤其ph值增加了0.3个单位，但在使用100年时略有下降，达到稳定的5.09（表1）。大多数养分含量随着水稻栽培时间推移而增加，而只有全钾（tk）略有下降。与使用5年的水稻土壤相比，100年土壤速效碳（available c）含量增加1.4倍，全氮和速效氮含量变化趋势相同，分别增加了1.4倍和1.6倍。全磷和速效磷含量在5–30年略有下降，此后分别逐渐增加到0.95g kg ⁻¹和74.6mg kg ⁻¹。土壤有机碳/全氮（c/n）的比值在5年内比贫瘠土地显著增加了1倍，此后保持在同一水平上。有机碳/总磷（c/p）的比值在5年内比贫瘠土地增加了1.5倍，并在30年时增加到37.7。

与贫瘠土壤相比，使用了5年的水稻土壤其β-木糖苷酶（βx），β-葡萄糖苷酶（βg）、n-乙酰氨基葡萄糖苷酶（nag）、酸性磷酸酶（ap）增加了1.2–9.8倍，与使用了5年的水稻土壤相比，使用了30年的水稻土壤这些酶活指标显著增加了0.6-1.8倍。

表1：水稻土壤化学性质随土壤使用时间而变化

 

水稻土壤微生物群落随土壤使用时间而变化

与贫瘠土壤相比，使用了5年的水稻土壤其磷脂脂肪酸（plfa）总含量，放线菌（actinomycete）plfa，真菌（fungal）plfa和细菌（bacterial）plfa增加了2.8–10.2倍（图1）。与使用了5年的水稻土壤相比，使用了30年的水稻土壤这些酶活指标显著增加了0.9–1.5倍。与使用了30年的水稻土壤相比，使用了100年的水稻土壤真菌plfa显著减少了42%。与贫瘠土壤相比，使用了5年的水稻土壤真菌/细菌plfa比值显著下降了64%，因此，我们得出的结论是：真菌plfa在贫瘠土壤上占主导地位，而细菌plfa在使用后的土壤上占主导地位。

 

 

图1  不同使用时间土壤中磷脂脂肪酸（plfa）总含量、放线菌（actinomycete）plfa，真菌（fungal）plfa和细菌（bacterial）plfa含量。

 

rda分析显示土壤有机碳/全氮（c/n）、速效磷（ap）和有机碳/全磷（c/p）是土壤微生物群落随土壤使用时间推移而变化的主要因素（图2）。

 

图2  营养成分和土壤pfla的rda分析。

土壤细菌α多态性随使用时间而变化

与贫瘠土壤相比，使用了5年的水稻土壤微生物丰富度指数ace和chao1分别增加了76.8和75%，这两个指数在15年内略有下降，然后在使用100年时逐渐增加到一个稳定状态。shannon指数在水稻种植开始5年内明显减少，在使用15年略有减少，此后在30年和100年逐渐增加到6.5稳定的稳定状态（图s1）。

 

图s1  不同使用时间土壤样本细菌α-多样性

土壤细菌系统发育β多样性随使用时间而变化

pca分析显示不同使用时间的土壤细菌群落结构具有明显差异（图s2）。贫瘠土壤与使用后的水稻土壤分离明显，使用5年和15年土壤样本聚集在一起，但是与使用30年和100年的土壤样本有明显不同。

 

图s2  不同使用时间土壤样本pca分析

 

绿弯菌门(chloroflexi)（一类通过光合作用产生能量的细菌）比例在使用5和15年后略有上升，然后逐渐下降，在100年达到稳定值（图s3a）。变形杆菌门（proteobacteria）， ignavibacteriae和nitrospirae phylum的比例在使用后的土壤样本中高于贫瘠土壤（图3b，e和i）。酸杆菌（acidobacteria）、厚壁菌门（firmicutes）、拟杆菌门（bacteroidetes）、放线菌门（actinobacteria）的比例在使用后的土壤样本中低于贫瘠土壤（图3sc，d，f和g）。

 

图s3细菌类群在门水平的相对丰度（%）。

 

基于进化β多样性分析，样本可分为三个阶段：1）非水稻土壤，水稻；（2）水稻土壤（< 30年：包括5年和15年）；（3）水稻土壤（≥30年：包括30年和100年）。lefse分析结果表明绿弯菌门(chloroflexi)、酸杆菌门类群2（acidobacteria-gp2）是第一阶段非水稻土壤类型的标志菌；厌氧绳菌纲（anaerolineaceae）是第二阶段水稻土壤初期的的标志菌；ignavibacterium 是是第三阶段水稻土壤中后期的标志菌（图s4）。

 

图s4 不同阶段水稻土壤样本的物种lefse分析

土壤化学性质与土壤微生物群落的关系

非水稻土壤细菌群落和水稻土壤细菌群落在rda1轴可以分开(82.3%)，使用5年和15年的样本聚集在rda2轴正截面（11.1%），使用30年和100年的样本聚集在rda2轴负截面（11.1%）（图3）。rda分析显示c/n、c/p、tp（总磷）、tk（总钾）是土壤微生物群落随土壤使用时间推移而变化的主要因素。

 

图3  微生物群落与土壤营养成分的rda分析。

研究结论：

1. 使用后的水稻土壤酶活性和土壤有机碳、氮、磷含量显著高于贫瘠土壤，且持续增加至少使用后的至少100年。

2. 土壤营养状况的改善使细菌比例逐渐高于真菌比例，并且快速增长的营养型细菌逐渐取代缓慢生长的寡营养型细菌。具有多种代谢功能的ignavibacterium 属是水稻土壤中后期（≥30年：包括30年和100年）的标志菌。

3. 细菌α多样性的变化趋于稳定，但水稻土壤使用30年后土壤物种丰富度继续增加。

4. 细菌β多样性分析表明，使用后的水稻土壤细菌群落结构与贫瘠土壤不同。使用5年和15年的样本聚集群与使用30年和100年的样本聚集群显著不同。

5. rda分析显示c/n、c/p是影响土壤微生物群落更替的主要因素。

6. 总体结论：长期的水稻种植导致土壤化学特性和微生物群落营养模式的变化，从而对应于土壤肥力的增加。