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发稿时间：2017-12-22来源：天昊生物

山西医科大学附属山西省人民医院消化科王俊平教授课题组近期在《world journal of gastroenterology 》上发表了功能性胃肠病患者的粪便和黏膜菌群与toll样受体2／toll样受体4表达相关性的研究。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的扩增子测序和生物信息分析工作。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。 

英文题目：faecal and mucosal microbiota in patients with functional gastrointestinal disorders: correlation with toll-like receptor 2/toll-like receptor 4 expression

中文题目：功能性胃肠病患者的粪便和黏膜菌群与toll样受体2/4表达之间的相关性

期刊名：world journal of gastroenterology     发表时间： 2017    if：3.365        

研究背景

最近的研究表明，肠道粪便（lm）微生物群和黏膜（mam）微生物群组成是不同的，这表明这两种微生物菌群在肠道微生态系统中起着不同的作用，肠道粪便微生物群（lm）是整个肠道排出的终产物，而黏膜（mam）微生物群常常代表某个特定部位的菌群特点，因为mam与宿主紧密接触，可能在肠道屏障方面有突出的作用，而lm可能在营养代谢和养分捕获方面起着关键的作用。

toll样受体（tlr）是固有免疫中模式识别受体，由胃肠道中的各种细胞表达。tlrs能识别各种微生物产物，在先天和适应性免疫途径激活方面起着非常重要的作用，其中tlr2和tlr4是研究最深入的两个，它们能对微生物膜组件响应。已经有许多研究证明了tlr信号在微生物引起的慢性炎症和免疫病中所起的重要作用，tlr可以直接与微生物互作，从而调节肠道免疫反应，在一些肠道疾病中，如炎症性肠病（ibd）或肠易激综合征（ibs），发现tlr2和tlr4的表达增加，并观察到微生态失调。然而，目前关于人类肠道菌群与tlr之间关系的数据还比较有限。

研究目的

对功能性胃肠病患者（fgids）中肠道粪便（lm）和黏膜（mam）微生物菌群进行比较，研究菌群与toll样受体tlr2和tlr4表达之间的相关性，从而调查哪些类型细菌调控tlrs的表达从而影响肠道的功能。

研究对象

共32名18-65岁的中国功能性胃肠病患者（fgids），其中包括14名腹泻型肠易激综合征患者，14名功能性消化不良（fd）患者，4名其它疾病患者。研究人群男女各半，平均年龄为49（20-65）岁，bmi平均为23.24kg/m²。参加这项研究的受试者在研究前6个月内没有服用糖皮质激素、阿片类药物、益生菌或抗生素类药物；无系统性合并症；无过量饮酒史；有胃肠道手术史或肠道器质性疾病的患者被排除在外；所有受试者在参与之前都签署知情同意书。从32个患者中收集了64个样本。每个患者同时提供一个粪便样品和一个结肠黏膜样品。

粪便样品采集和dna抽提：

在结肠镜检查前在家收集粪便样品。样品立即冷冻在-20°c，在6h内运输到研究中心，在分析前一直存放在-80°c，从粪便样品中抽提细菌dna采用qiaamp® dna stool mini kit (qiagen, hilden, germany)提取dna。

黏膜样品采集和dna抽提：

结肠黏膜活检样本在一次非弹性的结肠镜检查中收集，结肠黏膜活检取自降结肠。从结肠取出后，活检样本立即储存在-20°c，在6h内运输到研究中心，在分析前一直存放在-80°c，使用qiaamp dna mini kit (qiagen) 提取dna。

qpcr检测tlr2和tlr4表达：

从结肠活检样本中使用takara minibest universal rna extraction kit (takara, japan)提取总黏膜rna，qpcr检测tlr2和tlr4基因表达量。

测序技术

16s rrna扩增子测序（v3-v4）； 

研究结果

1. 肠道粪便样品表现出比黏膜样品更明显的多样性和丰富性，并且两者的菌群结构显著不同。

2. 肠道粪便（lm）和黏膜（mam）微生物群之间门分类水平上存在显著差异。例如lm中的主要菌群为拟杆菌门和厚壁菌门，其次是变形菌门，而mam中最主要菌群为变形菌门，其次就是厚壁菌门和拟杆菌门。

3. 检测了所有样本中tlr2和tlr4的mrna表达，结果发现tlr2的表达与tlr4呈显著正相关。

图3  tlr2的表达与tlr4呈显著正相关性

4. 在肠道粪便样本（lm）中，无论门、纲、目水平，没有细菌与tlr4表达呈相关性。而在粘膜样本（mam）中，firmicutes（门水平）；clostridia（纲水平）；clostridiales（目水平）；defluviitaleaceae、peptostreptococcaceae、ruminococcaceae（科水平）；faecalibacterium、ruminococcus（属水平）分别与tlr4表达显著负相关（图4）。

5. 肠道粪便（lm）和黏膜（mam）样本中的细菌与tlr2表达相关，然而菌群类型却很不同。在肠道粪便（lm）样本中，clostridia、bacilli（纲水平）；clostridiales、lactobacillales（目水平）；ruminococcaceae、streptococcaceae（科水平）；faecalibacterium、streptococcus（属水平）分别与tlr2表达显著负相关（图4）。

6. 在黏膜（mam）样本中，bacilli（纲水平）；lactobacillales（目水平）；carnobacteriaceae、streptococcaceae（科水平）；granulicatella、streptococcus（属水平）分别与tlr2表达显著负相关（图4）。

图4粪便（lm）和粘膜（mam）样本相关关键菌属和toll样受体tlr2和tlr4之间的相关性。蓝圈

表示正相关，而红圈代表负相关。

研究结论

中国功能性胃肠病患者（fgids）的肠道粪便（lm）和黏膜（mam）的微生物组成显著不同。toll样受体的表达可能是受肠道特定类型细菌的影响。