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发稿时间：2017-12-01来源：天昊生物

英文题目： dietary changes in nutritional studies shape the structural and functional composition of the pigs’ fecal microbiome—from days to weeks

中文题目：营养学研究中的饮食改变重塑猪粪便微生物物种和功能结构

期刊名：microbiome           发表时间： 2017.10.27     

发表单位：德国霍恩海姆大学动物科学学院

研究背景：

饮食改变对肠道菌群影响的研究主要集中在对感兴趣的饮食数天适应后。但是问题是，几天时间才足以反映微生物对饮食改变的适应。本文研究了饮食改变后4个星期内猪的肠道微生物组从而来了解这种适应所需要的时间。

研究对象： 

12头猪最初都用常规饮食喂养到12周，在13周的时候，动物们被随机分配到四个实验性饮食组，喂至第20周。随机分为4组。四种饮食中有两种含有低度可消化（ld）的豌豆粉作为蛋白质来源，剩下的两种饮食含有高度可消化（hd）的豆粕作为蛋白质来源。这些饮食组中的每一个都提供高浓度和低浓度钙磷（cap）：

（1） r1：豆粕，高度可消化（hd），高钙磷浓度（cap）；

（2） r2：豆粕，高度可消化（hd），低钙磷浓度（cap）；

（3） r3：豌豆粉，低度可消化（ld），高钙磷浓度（cap）；

（4） r4：豌豆粉，低度可消化（hd），低钙磷浓度（cap）；

在饮食改变后4个星期内连续收集粪便样品，共收集了84个粪便样品。有关实验和取样时间的详细资料如下表1。

表1  在跨度4周的实验周期内共收集了7次粪便样本，用于细菌16s扩增子测序和蛋白组分析。失败的dna分析用x*表示。

技术手段：

•  粪便样本细菌16s rdna扩增子测序（v1–v2）；
•  粪便样本和宿主样本蛋白组分析（液相色谱/质谱分析）；
•  粪便代谢产物（短链脂肪酸）分析（气相色谱分析）

研究结果：

1、 16s rdna测序和蛋白质组分析揭示了三个适应期

粪便16s rdna测序每个样本平均得到57,916± 2139条序列，共得到3497个otus。粪便蛋白质组分析分别鉴定到9703个细菌蛋白质。基于16s rdna测序和蛋白质组分析结果进行了pcoa分析，按着采样时间顺序，无论是16s rdna测序数据（图1a）还是蛋白质组分析数据（图1c）所有样本都分为3个集群，暗示肠道菌群的适应过程经历了三个适应期：zero周期（实验饮食管理前的阶段），代谢适应期（ma，挑战性饮食的适应期），平衡期（eq，建立一个新的合适的肠道菌群）。只有eq期间的不同浓度钙磷（cap）样本组能够分开，而其它两个期间的的不同浓度钙磷（cap）样本组不分开这一现象支持只有在平衡期（eq）重新建立了细菌群落（图1b，d）。另外3个不同适应时期鉴定到各自的otus和蛋白质，并且3个不同时期的otus和蛋白质相互重叠非常少。

图1  16s rdna测序（a,b）和蛋白质组分析（c,d）结果揭示了三个适应期。

2、 基于16s rdna测序和蛋白质组结果的物种分布

基于16s rdna测序，发现clostridiaceae，prevotellaceae 在eq时期明显增加，peptostreptococcaceae和bifidobacteriaceae在ma和eq时期都明显增加。而lactobacillaceae在eq时期相对于zero时期则明显减少（图2）。

蛋白质组结果支持上述肠道菌群随着时间进行重塑的结论。例如clostridiaceae，bifidobacteriaceae和bacteroidaceae相关蛋白都随着时间推移丰度增加。lachnospiraceae， veillonellaceae和erysipelotrichaceae相关蛋白随着时间推移丰度减少。prevotellaceae在ma时期明显减少，而在eq时期又恢复，表明它是zero和eq时期的重要功能细菌。而actobacillaceae, spirochaetaceae和 acidaminococcaceae在ma时期最高，在zero和eq时期则较少，表明它们在驱动从zero到eq时期转移过程中起非常重要的作用。

图2 基于16s rdna测序和蛋白质组结果表明肠道菌群组成随时间依赖性变化。

3、 肠道菌群的功能适应

三个适应期中的每一个特异蛋白质被认为是肠道菌群功能逐渐转移的重要功能性类别。将每个适应期的蛋白lfq值与其它2个适应期进行比较，具有至少5倍差异的蛋白质才被考虑进行kegg途径的进一步功能分类。图3所示的热图总结了不同适应期之间变化最大的途径，包括与它们表达有关的细菌家族。

clostridiaceae家族，其丰度在eq期增加，同时某些途径丰度也出现了同步增长，例如戊糖、葡萄糖醛酸转换途径和乙醛酸盐代谢途径。bifidobacteriaceae在eq时期的aminoacyl-t-rna biosynthesis和戊糖磷酸途径呈中度丰度表达。lachnospiraceae在eq时期丰度减少造成半乳糖代谢和甘油脂代谢突然下降。

图3菌群成员涉及多种途径。热图显示了10个最丰富的细菌家族在每个适应期选定途径中的贡献度。细菌家族特异的参与到某些途径中，对不同适应期的变化有贡献。

图4对某些碳水化合物代谢途径和其相关细菌家族进行了总结。在戊糖、葡萄糖醛酸转换通路，zero时期样品的蛋白质在这个通路中都表现出高丰度，说明zero时期细菌群落参与识别复杂底物和改善碳和能量吸收（图4a）。甘油脂代谢相关蛋白显示zero，ma和eq时期的细菌都参与甘油三酯和甘油酯生物合成（图4b）。对戊糖磷酸途径的蛋白研究表明不同的细菌蛋白参与了这个相同的功能（图4c）。参与半乳糖代谢通路的相关蛋白质在zero和eq时期丰度较高（图4d）。

图4  细菌群落在选定的碳水化合物途径中贡献不同。a戊糖、葡萄糖醛酸转换; b甘油脂代谢; c戊糖磷酸途径; d半乳糖代谢; 饼状图内的不同颜色代表每个鉴定蛋白质相关的细菌家族。饼的大小代表蛋白质的丰度。饼状图框架的颜色代表：红色，zero时期；蓝色，ma时期；绿色，eq时期。当饼状图很小不能区分不同适应期的明显差异时，使用彩色方块来表示所鉴定到的蛋白质。红色，zero时期；蓝色，ma时期；绿色，eq时期；黄色，所有时期；灰色，zero/ma共享；橙色：zero /eq共享；紫色：ma /eq共享。

4、 短链脂肪酸合成

使用蛋白组数据研究了参与甲酸酯、乙酸乙酯、丙酸酯和丁酸酯生物合成的酶，它们可以作为短链脂肪酸生成的指示物。结果表明丁酸合成酶的丰度随时间变化不大，而丙酸合成酶的丰度随时间呈逐渐下降趋势，甲酸和乙酸合成酶则逐步增加。

短链脂肪酸的气相色谱测定结果表明乙酸是最丰富的短链脂肪酸，随后是丙酸和丁酸。除了在低浓度钙磷（cap）样本中增加，丁酸浓度随时间变化不大。丙酸浓度在eq时期相对于zero时期稍微增加，乙酸浓度则没有变化。另外代谢物分析结果与蛋白组分析结果没有明显相关性。

5、 宿主蛋白质组受肠道微生物变化的影响

在这项研究中，共鉴定出513种猪蛋白，总体来看，动物蛋白的丰度谱证实了先前观察到的逐步适应过程，zero时期和eq时期具有完全不同的蛋白分布（图5）。在zero期发现的高丰度肌动蛋白α1 (gn =acta1)和膜联蛋白a4 (gn =anxa4)说明宿主参与细胞生长，运动和细胞周期等过程。在ma时期发现的高丰度磷脂酶a2 (gn=pla2g1b)说明宿主通过监测胃粘膜微生物群落结构来维持胃粘膜功能平衡。在eq时期发现的高丰度酪氨酸和色氨酸酶5激活蛋白(gn=ywhaz)，annexin a11（gn = anxa11）和微管蛋白β4b级ivb( tubb4b)说明宿主在eq时期出现了器官增大和动物生长现象。

图5 宿主蛋白质组受肠道微生物变化的影响。voronoi图显示了zero（a），ma（b）和eq（c）样本的宿主蛋白质组。蛋白质是可视化的多边形，其面积反映其相对丰度。

结论：

• 只猪在饮食改变后4周内的7个时间点取样，otus丰度和蛋白量化值分析表明3个不同适应时期完全分开：第1天的样本被定义为“zero期”；第1周和第2周的样本被合并为“代谢期（ma）”，第3周和第4周的样本被定义为“平衡期（eq）”。只有在eq时期，根据cap补充浓度不同分离是显著的。
• 蛋白组学获得共约9700个蛋白质，可用来推断细菌群落可能的代谢功能。
• 饮食结构变化导致了肠道细菌群落分类和功能逐渐重塑的过程，这种适应实际持续了数周，尽管通常假定只需几天的时间跨度。
• 本研究所获得的知识对未来营养研究的设计具有很重要的意义。此外，考虑到猪和人类胃肠道解剖和生理学之间的高度相似性，目前的研究结果对未来人类相关营养研究的设计具有非常重要的参考意义。