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发稿时间：2017-11-17来源：天昊生物

nature：高盐摄入-肠道菌群-免疫轴重大发现

副标题：盐敏感肠道菌群调节t_h 17细胞和疾病

英文题目： salt-responsive gut commensal modulates t_h 17 axis and disease

中文题目：盐敏感肠道菌群调节t_h 17轴和疾病

期刊名：nature           发表时间： 2017.11.16         

发表单位：德国马克斯-德尔布吕克分子医学中心

研究背景：

饮食中的高盐含量与许多疾病有关，特别心血管疾病，高盐饮食（hsd）的有害作用受动脉过度紧缩的驱动，并伴随着高发病率和高死亡率。迄今为止，大多数研究都聚焦在肾脏的作用，交感神经系统和对脉管系统的直接影响，然而，一些研究表明免疫系统在这些过程中，将炎性t细胞与高血压的发展联系起来，特别是白细胞介素­17a (il­17a)产生的cd4 t_h 17细胞可促进高血压。t_h 17细胞在自身免疫性疾病中起着有害作用，近年来的研究表明，高盐环境可促进致病性t_h 17细胞的产生。因此，高盐饮食（hsd）促进t_h 17细胞生殖，从而诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（eae）恶化。活跃髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（mog）诱导的eae是一种概括了多发性硬化症很多方面的疾病模型，尽管它在t细胞功能的多个方面不同于转基因eae模型。hsd和肠道微生物之间的相互作用还没有彻底研究。目前已经知道肠道微生物响应饮食成分的波动，会导致暂时性或持续性的肠道菌群改变。饮食诱导的微生物群落组成变化可能对宿主产生深远的影响，特别是对t细胞，目前已经知道t_h 17细胞受某些特定细菌丰度的影响特别大。因此本文研究了hsd对肠道微生物和免疫系统的影响。

研究对象： 喂正常盐分饮食（nsd）或高盐饮食（hsd）fvb/n小鼠或志愿者；

技术手段：16s rdna扩增子测序（v4–v5）；气相色谱-质谱（gc-ms）；流式细胞技术；宏基因组测序；菌株全基因组测序；qpcr

研究结果：

1、 高盐降低小鼠乳酸菌

两组类型喂养小鼠具有类似的体重和食物摄入量。相对于nsd喂养的小鼠，hsd喂养的小鼠具有显著较高的流体和盐摄入量，但是它们具有相似的肠传输。尽管两组类型喂养小鼠具有类似的微生物组成，但是在喂养14天时，乳酸菌,oscillibacter, pseudoflavonifractor, clostridium xiva, johnsonella, rothia等几种菌属显著减少，而parasutterella则显著增加。

值得注意的是，粪便代谢产物分析结果表明两组类型喂养小鼠在中心碳、氮代谢途径上具有明显差异。考虑到代谢产物的差异，虽然没有大规模的微生物分类学差异是出乎意料的，但这与两种饮食的能量含量相同，只是盐含量不同的事实却是一致的。

使用adaboost分类器确定了8种具有非平凡特征重要性（图1a，c）并且准确率高达92%（图1b）的otus。这些otus的最大相对丰度范围是0.04%-19.5%，并且它们对高盐饮食（hsd）的反应不同（图1a，c）。最重要的otu（25%特征重要性）是乳酸杆菌属的一个成员，其在喂养hsd后被耗尽（图1d），乳酸菌消耗非常快速，在喂养hsd 1天后就可以检测到这种趋势，在喂养hsd 14天后其具有最低丰度，而当重新喂养nsd后，乳酸菌otu丰度返回基准水平（图1d）。

图1  hsd改变小鼠粪便微生物和消耗乳酸杆菌。

由于乳酸菌otu是与高盐最密切相关的细菌群，因此我们从小鼠粪便中分离出一个乳酸菌菌株，这个菌株的16s rdna序列与扩增子测序的v4–v5序列100%相同，因此鉴定为l. murinus。通过qpcr确认在喂养hsd后丰度减少（图1e，f）。l. murinus的全基因组测序结果与已发表的2种l. murinus序列有93%同源性。值得注意的是，目前没有一个l. murinus菌株是原产于人类微生物群，人类肠道微生物群中最同源的16s序列也只有不到90%核苷酸同源性。

接下来，在体外培养了人相关的l. murinus菌株和非相关对照菌株，并且测试了它们在nacl浓度增加情况下的生长状况，结果发现在相对较低nacl浓度就抑制了人相关的l. murinus菌株生长，除了唾液乳酸杆菌。

因为乳酸杆菌将色氨酸代谢为吲哚代谢物是已知的，因此推测hsd喂养会减少粪便吲哚代谢物，结果发现hsd会显著降低粪便吲哚乳酸（ila，图1g）和吲哚乙酸（iaa）水平，而吲哚甲醛是不变的（iald）。与无菌小鼠相比，只喂养l. murinus菌株小鼠具有较高水平的粪便ila，iaa和iald （图1h）。

图1  hsd改变小鼠粪便微生物和消耗乳酸杆菌。

2、 l. murinus能改善eae

肠道菌群最近被确认对多发性硬化和实验性自身免疫性脑脊髓炎（eae）非常重要。hsd对l. murinus的抑制促使我们调查口服l. murinus是否能改善hsd诱导的活跃髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（mog）导致的eae（脑炎小鼠模型）恶化。依靠每日灌胃维护hsd喂养期间的l. murinus丰度和粪便吲哚代谢物。hsd组小鼠表现出恶化的病程（图2a），hsd和nsd喂养期间补充l. murinus则可以改善疾病。

3、 l. murinus可减少t_h 17细胞

通过流式细胞仪分析了mog免疫后第3天cd4 小肠固有层淋巴细胞（silpl）产生的il17a，结果发现hsd喂养的小鼠有显着较高的t_h 17频率相比于nsd喂养的老鼠，这种频率可以通过喂养l. murinus来降低（图2b）。mog免疫后第17天的脾细胞和脊髓浸润淋巴细胞流式细胞仪分析发现喂养l. murinus来降低可显著减少t_h 17细胞（图2c，d）。脊髓组织中的il17a 和rorc转录水平也降低。hsd和l. murinus的效果很可能是对t_h 17细胞特异的，因为silpl，脾或脊髓中干扰素(ifnγ)产生的cd4 淋巴细胞没有受到影响。

图2  l. murinus喂养会阻止高盐诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（eae），并且减少t _h 17细胞数量

为了阐述对t_h 17细胞的调控机制，我们专注于粪便吲哚代谢物，因为吲哚代谢物积极诱导eae是众所周知的。hsd明显减少粪便吲哚乳酸ila，而补充l. murinus则可以防止这种影响（图3a，b）。接下来研究了ila在体外对小鼠t_h 17细胞分化的作用，结果发现ila显著降低t_h 17细胞分化（图3c）。然而在mog免疫的肠道无菌小鼠，hsd没有改变t_h 17细胞细胞的频率相比于nsd组，这表示肠道细菌在hsd调控t_h 17细胞方面起着至关重要的作用。

图3  吲哚乳酸ila的可能功能。

4、 l. murinus降低盐敏感性高血压

越来越多的证据表明t_h 17细胞在高血压病发生过程中起非常重要的角色，而l. murinus可减少t_h 17细胞，因此想检测l. murinus处理是否可以降低盐敏感高血压。在hsd喂养3周后血压升高（图4a，b），而每天l. murinus治疗则导致收缩压显著降低和舒张压正常化。

接下来想知道l. murinus治疗是否影响盐敏感性高血压中的t _h 17细胞，相比于nsd，hsd导致cd4 显著增加silpl中cd4 rorγ t   t _h 17细胞频率，由l. murinus治疗则显著降低这种细胞频率（图4c）。silpl，clpl 和脾淋巴细胞流式细胞分析结果表明相对于hsd组，l. murinus治疗显著降低t _h 17细胞频率（图4d–f），因此，l. murinus可以阻止hsd导致的t _h 17细胞增殖，从而改善盐敏感高血压。

图4  l. murinus降低盐敏感性高血压和减少t _h 17细胞数量。

5、 健康人的盐挑战

为了在人类中证实研究结果，我们进行了一项研究男性志愿者的初步研究。参与者盐摄入量增加14天，我们在8名受试者的亚组中监测了基线血压和盐刺激后的动态血压。与基线相比，高盐挑战显著增加平均收缩压和舒张压（图5a）。由于hsd增加了小鼠t _h 17细胞的数量，我们分析了高盐挑战前后人体血液中的t _h 17细胞数量，外周血淋巴细胞的流式细胞结果显示cd4  il­17a tnf  t _h 17细胞增加（图5b）       

为了研究高盐挑战对人体肠道微生物的影响，我们使用宏基因组测序分析了高盐挑战前后粪便样本中乳酸菌的丰度，41.7%的受试者（共12个）中在基线至少有一个肠道乳酸杆菌属阳性，总的来说，我们在基线检测到七种不同的肠道乳酸杆菌菌种（图5c）。在高盐挑战之后，在最初存在的十个乳酸菌种群中有九个不能在各自的研究对象被检测到，这意味着乳杆菌属的消耗（图5c）。我们重新分析了121个时间推移的健康肠道宏基因组测序数据，kaplan–meier生存分析结果表明hsd组的乳酸菌肠道菌群存活率显著降低（图5d）。

图5 高盐挑战影响健康人的血压，t _h 17细胞数目和乳酸杆菌。

结论：

高盐饮食的生活方式会导致高血压和心血管疾病, 高盐会通过诱导t _h 17细胞来驱动自身免疫，从而导致高血压。本研究发现高盐摄入会影响小鼠的肠道微生物，特别会消耗乳酸杆菌（lactobacillus murinus）。因此l. murinus喂养小鼠会阻止高盐诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（eae），并且通过减少t _h 17细胞数量来阻止高血压。根据这些发现，人体的适度高盐挑战降低了乳酸杆菌的肠道存活率，增加了t _h 17细胞数量，并且造成血压升高。本文的研究结果将高盐摄入与肠道–免疫轴联系在一起，强调了肠道微生物可作为抗盐敏感的潜在治疗靶点。