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发稿时间：2017-11-14来源：天昊生物

副标题：胰腺囊肿液具有独特的微生态系统

英文题目： pancreatic cyst fluid harbors a unique microbiome

中文题目：胰腺囊肿液具有独特的微生物

期刊名：microbiome            发表时间： 2017.11           影响因子：  8.496

发表单位：荷兰鹿特丹医学中心胃肠病学和肝病学系

研究对象：在进行超声内镜引导下细针穿刺活检（eus-fna）时收集 69疑似囊性病变患者的胰腺囊肿液（pcf）：1）27例胰腺导管内乳头状腺瘤(ipmn)患者：2例主分支型ipmn患者；4例弥漫型ipmn患者；12例单病灶侧分支ipmn患者；4例多病灶侧分支ipmn患者；5例未确定类型ipmn患者；2）13例粘液性囊性肿瘤（mcn）患者；3）9例胰腺假性囊肿患者；4）9例浆液性囊腺瘤（sca）患者；5）11例具有明显多种形式的囊性病变，胃肠间质瘤（gist），神经内分泌肿瘤（net），或没有明确的临床诊断，这11例患者定义为其它。胰腺囊肿液存储在−150°c。

表1胰腺囊肿患者的临床及病理特点

dna提取试剂盒：300 μl的胰腺囊肿液用于dna提取，试剂盒为wizard dna isolation kit (catalog no. a1620, promega bnl b.v)

技术手段：16s rrna 扩增子测序（v3-v4）

研究背景： 很明显，特定的肠道细菌参与胃肠道不同癌前病变的发展。然而对胰腺囊性病变微生物成分的分析尚未完成。这就促使我们探讨内镜下获得的胰腺囊肿液体（pcf）是否含有细菌，并确定该材料中存在的细菌属。

研究结果：

1、 细菌dna存在于eus-fna收集的胰腺囊肿液中

目前尚不清楚胰腺囊液是否有微生物成分，通过16s rrna pcr分析发现69例胰腺囊肿液样本中有64例存在细菌dna（表2）。囊肿液中细菌dna的存在与病变类型无显著关联：在粘液性囊性肿瘤（mcn）患者中，100%样品含有大量细菌dna；在ipmn样本，92.6%样品含有大量细菌dna；在假性囊肿和浆液性囊腺瘤，88.9%样品含有大量细菌dna；在其它组，90.9%样品含有大量细菌dna。

表2使用pcr，sanger测序和ngs确定胰腺囊肿液中的细菌生态系统特点

2、 不同临床类型胰腺囊肿液的微生物组成

16s rrna通用引物pcr产物的sanger测序结果显示69个样品中有13个样品存在fusobacterium spp.（梭菌属）。pcf中另一个主要细菌是bacillus spp.（芽孢杆菌），69个样品中有16个样品都存在这个菌。另外还检测到的细菌包括：ruminococcus spp., staphylococcus spp., caldimonas spp., arthrobacter spp., acinetobacter spp., bacteroides spp., orpinomycesspp., anaerococcus spp.（表2）。

为了确认这些细菌存在和深入了解pcf中的细菌组成，16s rrna基因拷贝数最高的23个pcf样品进行了16s rrna （v3-v4） 扩增子测序。结果发现：丰度最高的菌属分别是：bacteroides（类杆菌属）, escherichia（埃希氏菌属）/shigella（志贺氏菌属）,  acidaminococcus（氨基酸球菌属）（图2）。不同类型的囊肿在微生物组成上无统计学差异。另外不同组别的多样性指数也相似（图3）。

图2. 33个胰腺囊肿液体样品微生物属的分类组成。a 浆液性囊腺瘤（sca）微生物组成; b胰腺导管内乳头状腺瘤(ipmn)微生物组成；c胰腺假性囊肿微生物组成；d粘液性囊性肿瘤（mcn）微生物组成;

图2. 胰腺囊肿液体样品的微生物多样性香农指数。

3、 囊肿类型和切除术后的多样性

不同类型囊肿之间、切除组与非切除组之间、癌胚抗原（cea）和癌抗原19.9（ca19.9）之间微生物多样性指数也相似。这个结果与不同类型囊肿16s rrna通用引物pcr产物的sanger测序结果一致。

4、 胰腺囊肿液微生物组成表明其是一个独特的生态系统

将pcf细菌组成和人类微生物组计划（hmp）13个不同身体部位微生物组成进行比较发现：与粪便比较时，pcf具有26种独特的细菌基因型；与喉道比较时，pcf具有27种独特的细菌基因型；与舌背比较时，pcf具有28种独特的细菌基因型；另外pcf中有36种独特的细菌基因型不存在于任何其它身体部位（图4）。

图4. 胰腺囊肿具有一个与其它人体不同的独特微生物组成。与其它身体部位相比，使用二项式检验和anova 检验发现pcf中存在27-314种差异细菌基因型。

anova分析（确定细菌种群的影响大小）发现：将pcf细菌组成和hmp不同身体部位细菌组成进行比较时有314细菌菌群具有影响大小的变化，高影响菌种如图5所示，这个结果说明pcf含有独特的微生物组成，但是唯一性不能归咎于某个单一的菌属。

图5. 单个菌属对pcf独特性的贡献。相对于其他13个身体部位，pcf中的82个丰度差异菌属以及对pcf独特性的相对贡献。

相对于其他13个身体部位，pcf中存在相对高丰度和低丰度的特异菌种：pcf中有17种丰度较高的特异菌种，如拟杆菌属、埃希氏菌属/志贺氏菌属、普氏菌属、氨基酸球菌属属、鞘氨醇单胞菌属、双歧杆菌属等，这些细菌被证明在结肠、肺和肝癌的发生和发展中起作用。另外有15种细菌菌属在13个身体部位丰度较高：链球菌属、丙酸杆菌属、乳酸杆菌、梭杆菌属、棒状杆菌属、韦荣氏球菌属、奈瑟菌属、葡萄球菌属等，这些菌同时也是pcf中存在最少的细菌。这个比较说明pcf中定植的细菌是独一无二的，pcf存在的高丰度菌属具有在癌微环境中繁殖和喂食肿瘤的倾向（图6）。

图6. 相对于其他13个身体部位，pcf中存在相对高丰度和低丰度的特异菌种

结论：

•  观察到常规pcr的检出率为98.2%，而使用ngs的胰腺囊液（pcf）细菌检出率则高达100%。
•  相对于其他13个身体部位，pcf中有17种丰度较高的特异菌种，如拟杆菌属、埃希氏菌属/志贺氏菌属、氨基酸球菌属属等菌属。
•  这些结果揭示了胰腺囊液中存在一个明显特异的细菌生态系统。这其中包括一些具有潜在有害功能的细菌类群，这表明在这一生态位的独特微生物有可能促进胰腺肿瘤进程。