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发稿时间：2017-11-14来源：天昊生物

 

南京农业大学食品科学与技术学院近期在《journal of agricultural and food chemistry》上发表了苦丁茶中二咖啡酰奎宁酸对肠道微生态调节作用的文章。在恭喜天昊生物客户发表微生物文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：modulating effects of dicaffeoylquinic acids from ilex kudingcha on intestinal microecology in vitro  

中文题目：苦丁茶中二咖啡酰奎宁酸对肠道微生态的调节作用 

期刊名：journal of agricultural and food chemistry     

发表时间： 2017年10月    影响因子： 3.1540

材料方法:

实验设计

体外发酵实验共包含11组：一组不加碳水化合物（blk）和四组包含不同碳水化合物（glu，suc，gos和inl）；一个原始状态组(or)和五组添加苦丁茶二咖啡酰奎宁酸（dicqas）。

材料与试剂

苦丁茶、葡萄糖（glu）、蔗糖（suc）、菊粉（inl）、糖麻（gos）、乙酸、丙酸、n-butyric、i-butyric、n-valeric、i-valeric、2-ethylbutyric acids、甲醇、甲酸。

dicqas制备

苦丁茶dicqas根据报道方法进行一些修改：苦丁茶用热水提取，产生的输液过滤，冷却至室温，装上大孔树脂柱吸附，用紫外分光光度计在线监测柱，用纯水洗脱，直到出水在325 nm处不吸收，用乙醇溶液（70%，v/v）洗脱目标部位，收集出水真空浓缩、冷冻冻干。

体外厌氧发酵

使用粪便微生物体外厌氧发酵的方法来调查dicqas对肠道菌群的影响。粪便样品从4名健康志愿者获得（2名男性和2名女性，22 - 28岁），没有任何胃肠道疾病或在过去的3个月没服用任何抗生素、益生菌、益生元、泻药。将粪便样品混合在一起，用蒸压生理盐水溶液稀释10次，得到10%（w／v）悬浮液。悬浮液离心4℃，而上清液用于下面发酵的粪浆。准备基础营养生长培养基，葡萄糖（glu）、蔗糖（suc）、菊粉（inl）、糖麻（gos）（10 g/l）分别添加到培养基中。微生物发酵系统由2毫升粪浆和18毫升培养基组成。不添加dicqas含葡萄糖、蔗糖，糖麻、菊粉、不加任何碳水化合物分别定义为glu, suc, gos, inl,blk；而添加dicqas (1.0 g/l) 含葡萄糖、蔗糖，糖麻、菊粉、不加任何碳水化合物分别定义为glud, sucd, gosd, inld, blkd。每个体外发酵试验包含3个生物学重复。发酵系统在mgc缺氧密闭系统进行，37℃孵育24 h。每6小时轻轻摇动，使发酵系统尽可能均匀。培养后，采样用于细菌dna提取，冻在20℃用于scfa分析。

miseq测序

细菌测序区段为：（v4）

研究结果：

厌氧发酵后菌群的丰富度和多样性。

33个样本的平均测序数据量（clean data）为43029 ± 6733 序列。共检测到316 个otus，平均每个样本检测到160 ± 21 otus。稀释性曲线和shannon曲线表明大多数物种被检测到（图1）。

 

图1 所有样本的稀释性曲线（a）和香农指数曲线（b）。

α多样性指数如表1所示：inl组微生物多样性最低，而blk组微生物多样性最高。与不添加dicqas组相比，添加苦丁茶dicqas增加了α多样性。无碳水化合物培养时，dicqas添加会降低微生物多样性(与blk相比，blkd的shannon指数更低，而simpson指数更高)。据报道，肠道菌群多样性与宿主健康密切相关，肥胖个体肠道微生物多样性显著低于瘦肉型个体，shannon指数与脂肪组织呈显著负相关。本研究结果表明：dicqas能增加肠道菌群多样性，表明苦丁茶的dicqas具有通过调节肠道菌群抵抗肥胖的能力。

表1 各组α多样性指数分析

 

dicqas对整体微生物结构影响

•  聚类分析结果表明，所有样品可分为两个主要群体：dicqas添加组和无dicqas组，无碳水化合物添加发酵组(blk和blkd)与dicqas添加组比较相近，or组与无dicqas组比较类似（图2a）。
• 不同类型碳水化合物添加发酵组可以分为不同的亚群，但是它们之间的距离小于dicqas引起的距离（图2b）。
• nmds分析表明dicqas添加组(glud, sucd, gosd, inld, 绿色圈)和无dicqas组(glu, suc, gos, inl, 蓝色圈)在axis 1完全分离，说明它们之间有明显差异（图2c）。
•  cca分析表明dicqas对体外发酵的影响要明显大于碳水化合物（葡萄糖、蔗糖、糖麻和菊粉）影响，这表明dicqas是肠道菌群的主要调节因素。

 

图2  otus水平微生物的聚类分析（a）、热图分析（b）、nmds分析（c）、cca分析（d）。

门和属水平微生物群落组成

• 所有的发酵样品主要包括厚壁菌，拟杆菌，变形菌、放线菌、梭杆菌（图3a）。
• 添加dicqas降低了各类型碳水化合物条件下厚壁菌门的相对丰度（图3b）。
• dicqas对拟杆菌的相对丰度影响不大，除了gos作为碳源时dicqas显著降低其丰度（图3c）。
• 在所有碳水化合物甚至不加碳水化合物条件下，添加dicqas降低了厚壁菌门/拟杆菌门（f / b）比例（图3d）。肠道菌群的吸收能力与f / b值密切相关，添加dicqas导致f / b值降低预示着其抗肥胖的潜在能力。
• 添加dicqas显著增加放线菌丰度，特别是在gos发酵组（图3e）。类似于dicqas，槲皮素和儿茶素已被报道可以提高放线菌丰度，但葛根素则没有这种能力。

 

 

 

图3门水平微生物组成（a、群落结构柱状图；b、厚壁菌门的相对丰度；c、拟杆菌门的相对丰度；d、厚壁菌门/拟杆菌门（f / b）比例；e、放线菌门的相对丰度）。

属水平微生物组成图显示（图4），dicqas可以增加碳水化合物发酵组中bacteroides（拟杆菌）,  bifidobacterium（双歧杆菌）和 escherichia/shigella（大肠杆菌/志贺菌）的丰度，同时降低prevotella（普氏菌）,  megamonas（巨单胞菌）, dialister（嗜血杆菌），anaerostipes丰度。值得注意的是，gosd组双歧杆菌的丰度高于gos组和其它dicqas添加组，表明α- gos和dicqas可协同促进双歧杆菌增殖。

 

图4 属水平上的微生物组成（a、群落结构柱状图；b、热图）。

dicqas对微生物组成差异的影响

lefse分析显示在葡萄糖、蔗糖、糖麻和菊粉存在情况下，添加dicqas可以分别增加20, 17, 20和22个属丰度（其中有14个属是组间共有），也可以分别减少10，10，11，8个属丰度（其中有6个属是组间共有）（图5）。

 

图5  属水平上的lefse分析(a, glu vs. glud; b, suc vs. sucd; c, gos vs. gosd; d, inl vs. inld)。

把无dicqas组(glu, suc, gos, inl)定义为c群，dicqas添加组(glud, sucd, gosd, inld)定义为cd群。c群和cd群的差异趋势与上面不同碳水化合物条件得到的比较结果一致。在门水平，cd组比c组具有较高丰度的放线菌门和变形菌门，而厚壁菌门在c组更常见。在纲水平，添加dicqas减少了negativicutes丰度, 增加了放线菌纲,芽孢杆菌纲,γ-变形菌纲，α-变形菌纲丰度。在科水平，添加dicqas增加了双歧杆菌科等12个物种丰度，同时抑制了sreptococcaceae, prevotellaceae,veillonellaceae等物种丰度。很显然，dicqas表现出对双歧杆菌增殖显著的正效应。而双歧杆菌是一种被广泛研究的益生菌，它能降低肥胖的风险和发生率，其丰度与肥胖者内毒素水平呈负相关。其促进健康的机制涉及多种作用，如粘附到肠上皮细胞，产生有益的代谢产物，增强肠道屏障，调节免疫反应，以及竞争性排斥病原体。

 

图6 无dicqas组(c)和dicqas添加组（cd）属水平上的lefse分析。

dicqas对短链脂肪酸（scfa）的影响

大肠是人类产生短链脂肪酸的主要场所，栖息在那里的肠道微生物起着至关重要的作用。有机酸，包括乳酸、丙酮酸和乙酸，都来自碳水化合物的发酵，也可以由微生物进一步转化为丙酸和丁酸。短链脂肪酸对维持人体健康具有多功能，并能保护肠黏膜屏障，降低炎症反应水平，刺激肠胃蠕动。丁酸是一种重要的微生物代谢产物，它是结肠上皮细胞的主要能量来源，具有调节宿主基因表达，细胞分化和凋亡的功能。乙酸能促进肠粘液分泌，丙酸可能在调节食欲方面起关键作用。

本文短链脂肪酸（scfa）分析结果如表2所示，在所有的短链脂肪酸中，乙酸，丙酸和乳酸是最丰富的有机酸，丁酸也占一定比例。在无任何碳水化合物条件下，dicqas抑制所有有机酸（除乳酸）和总酸，例如在它们的浓度在blkd组中较blk组低。在任何碳水化合物条件下，添加dicqas可促进乙酸和乳酸产生，例如 (glud, sucd, gosd)组较(glu, suc, gos)组多；添加dicqas可减少丙酸和n-butyric（正丁酸）的含量。此外，blk组的i-butyric, n-butyric，i-valeric 浓度最高。

表2 短链脂肪酸、乳酸和总酸的浓度

总结：

膳食多酚已被视为新的益生元，多酚可以通过调节肠道菌群发挥作用。苦丁茶的多种生物活性可能来源于它的酚类化合物，但苦丁茶中二咖啡酰奎尼酸（dicqas）对肠道菌群的影响目前没有被调查过。研究发现dicqas可以提高微生物多样性，并且dicqas对微生物的影响高于碳水化合物（葡萄糖、蔗糖、糖麻和菊粉）对微生物的影响。添加dicqas可以增加拟杆菌、双歧杆菌、梭状芽孢杆菌、志贺氏菌等菌相对丰度，降低瘤胃球菌，小杆菌，巨型球菌等菌相对丰度。dicqas也可以通过微生物影响了短链脂肪酸的产生，例如乙酸和乳酸含量增加，丙酸和丁酸生成减少。总的来说，苦丁茶中的二咖啡酰奎尼酸（dicqas）在体外对肠道菌群有显著的调节作用，这表明dicqas具有被开发成功能性食品的潜力，通过促进肠道健康预防疾病的发生。

关于天昊：

      天昊生物采用miseq pe250测序策略对细菌16s rdna区/真菌its区/真菌18s rdna区的双v区或多种单v区进行测序，使用低循环数扩增，保证每个样品扩增的循环数统一；采用特殊方法可有效避免系统内误差；数据质量高，有效序列q30达到90%以上；加上最新升级的分析内容和解释详尽的结题报告，带您享受极致的微生物扩增子测序体验。