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发稿时间：2017-11-09来源：天昊生物

 

南京农业大学食品科学与技术学院近期在《food & function》上发表了杏鲍菇多糖（pep）对粪便微生物组成和免疫应答影响的文章。在恭喜天昊生物客户发表微生物文章同时，想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目： in vivo fermentation of a pleurotus eryngii polysaccharide and its effects on fecal microbiota composition and immune response

中文题目：杏鲍菇多糖（pep）对粪便微生物组成和免疫应答影响 

期刊名：food & function       影响因子： 3.2469

材料方法:

实验设计

所有老鼠都被关在笼子里，随机分为四组，每组10只小鼠：（1）pep低剂量组（lp）：小鼠口服给药每公斤体重0.2克pep；（2）pep中剂量组（mp）：小鼠口服给药每公斤体重0.4克pep；（3）pep高剂量组（hp）：小鼠口服给药每公斤体重0.8克pep；（4）对照组（蒸馏水）。所有小鼠口服给予pep或蒸馏水在实验周期上午9:00左右灌胃。每只小鼠口服给药量根据每天的体重进行调整。在实验期6周后，收集小鼠粪便，用于粪便dna提取。二乙基乙醚麻醉，颈椎脱臼法处死实验小鼠，在无菌条件下，冷板上纵向解剖获得内容物，每节内容物分成3等份，保存在20−°c用于短链脂肪酸浓度、水分含量、ph值测定。

miseq测序

16s细菌扩增子测序区段为：（v4）。

材料和化学品

新鲜杏鲍菇购买自当地。6种高纯度的scfa（短链脂肪酸）（乙酸、丙酸、i-butyric acids、n-butyric acids、i-valeric acids、n-valeric acids）用于标准溶液的制备。

实验动物

c57bl／6雄性小鼠（6周龄）体重20± 2克，动物适应以下环境两周：温度，25 ± 2 °c；相对湿度，50 ± 5%；12/12小时光暗循环。整个实验过程接受标准饮食。

pep的制备与表征分析

pep制备是根据前期研究进行。pep表征分析，包括纯度检测、均匀性和分子量测定、单糖组成分析、硫酸和糖醛酸含量测定、紫外（uv）光谱和傅里叶变换红外（ft-ir）光谱分析。

研究结果：

pep基本结构

pep的纯度、分子量、单糖组成、硫酸根含量请见表1。在260 nm和280 nm处没有吸收峰，光谱分析表明pep中没有核酸或蛋白质存在（图1a）。pep的ft-ir光谱在500-4000cm⁻¹，3399.9 cm⁻¹位置广阔的伸展峰代表了羟基基团(–oh)，揭示了pep多糖链较强的分子内与分子间相互作用（图1b）。

表1  pep的基本特征（纯度、分子量、糖醛酸、硫酸及单糖组成）

 

 

图1   pep的紫外（uv）光谱和傅里叶变换红外（ft-ir）光谱

scfa（短链脂肪酸）的测定

对照组和不同剂量pep口服小鼠的scfa总浓度如图2所示：相对于对照组，mp和hp喂养组在盲肠具有显著较高的scfa总浓度。相对于盲肠内容物，结肠内容物具有显著较低的scfa总浓度。随着pep剂量增加，盲肠和结肠内容物中的总scfa浓度分别从13.41 ± 1.78 mmol l ⁻¹，5.91 ± 1.23 mmol l⁻¹增加到22.08 ±1.74 mmol l⁻¹ ，7.40 ± 1.65mmol l⁻¹。

 

图2 对照组和不同剂量pep口服小鼠结肠和盲肠内容物的scfa总浓度

相对于对照组，高剂量pep喂养组（hp）在盲肠具有显著较高的乙酸浓度（图3a），然而结肠在对照组和pep喂养组无显著变化。相对于对照组，高剂量pep喂养组（hp）在盲肠具有显著较高的丙酸浓度（图3b），然而结肠在对照组和pep喂养组无显著变化。相对于对照组，高剂量pep喂养组（hp）在盲肠具有显著较高的两种丁酸浓度（图3c,d）。相对于对照组，高剂量pep喂养组（hp）在盲肠和结肠都具有显著较高的i-valeric浓度（图3e）。而n-valeric在对照组和pep喂养组的盲肠无显著变化（图3f）。

 

图3对照组和不同剂量pep口服小鼠结肠和盲肠内容物的乙酸（a）、丙酸（b）、i-butyric acids (c)、n-butyric acids (d)、i-valeric acids (e)、n-valeric acids (f)。

结肠和盲肠内容物ph值和含水量

口服pep后，结肠和盲肠内容物的ph值随着pep剂量增加而降低（图4a），这可能是由于胃肠道微生物的pep发酵产物所致。口服pep后，结肠和盲肠内容物的含水量随着pep剂量增加而升高（图4b），这可以归因于整个实验期间胃肠道内容物pep强大的持水能力。

 

图4 对照组和不同剂量pep口服小鼠结肠和盲肠内容物的ph值（a）和含水量（b）。

粪便微生物组成

口服pep 会导致粪便丰富度增加。厚壁菌、拟杆菌、变形杆菌是主要的门，相对于对照组，高剂量pep喂养组厚壁菌门的相对丰度明显减少，而拟杆菌门明显增加（图5a）；纲水平，高剂量pep喂养组bacterioidia 和bacilli的相对丰度增加, clostridia的相对丰度减少（图5b）；目水平，高剂量pep喂养组bacteroidales和lactobacillales的相对丰度显著增加，clostridiales的相对丰度减少（图5c）；科水平，高剂量pep喂养组porphyromonadaceae，rikenellaceae，bacteroidaceae，lactobacillaceae的相对丰度显著增加，lachnospiraceae and ruminococcaceae的相对丰度减少（图5d）;

 

图5对照组和不同剂量pep口服小鼠粪便菌群在门（a）、纲（b）、目（c）、科（d）水平上的分类。0–1到0–10, 1–1到1–10, 2–1到2–10，3–1到3–10粪便代表对照组，lp组，mp 组，hp组。

小鼠粪便菌群热图表明低剂量pep喂养组和对照组的粪便菌群比较类似，中剂量pep喂养组和高低剂量pep喂养组的粪便菌群比较接近（图6）。

 

图6 对照组和不同剂量pep口服小鼠粪便菌群热图分析。0–1到0–10, 1–1到1–10, 2–1到2–10，3–1到3–10粪便代表对照组，lp组，mp 组，hp组。

pcoa分析显示各组间微生物群落具有差异性（图7）。

图7对照组和不同剂量pep口服小鼠粪便菌群pcoa分析。

免疫应答分析

在全程灌胃期间，不同组别每星期小鼠体重变化没有差异，说明不同处理组小鼠的健康状况相同。脾脏、肝脏和胸腺指数如下表2所示。相对于对照组，高剂量pep喂养组胸腺指数具有非常显著性差异（p＜0.01），脾脏、肝脏指数则有显著性差异（p＜0.05）。

表2  pep处理对脏器指数的影响

 

各组血清及肠内容物中的免疫细胞因子分泌情况如图8所示。pep处理后血清il-12浓度无显著变化。然而，相对于对照组，高剂量pep喂养组的血清tnf-α，ifn-γ，il-1，il-2， il-6和盲肠和结肠slga显著增加，提示了pep的免疫功能调节作用。

 

图8  pep对血清免疫细胞因子（a, tnf-α; b, ifn-γ; c, il-1; d, il-2; e, il-6; f, il-12）和盲肠(h)和结肠(i)slga的影响，n=10。

总结：

• 对照组与高剂量pep喂养组（hp）小鼠盲肠和结肠内容物的短链脂肪酸浓度、ph值和水分含量显著不同。
• 对照组与pep处理组的粪便菌群结构有显著差异， 紫单胞菌科、、拟杆菌科、乳杆菌科丰度均在pep处理组增加。
• 高剂量pep口服给药后的免疫反应显著改变。这项探索性研究表明pep的摄入对胃肠道健康有积极作用。

关于天昊：

      天昊生物采用miseq pe250测序策略对细菌16s rdna区/真菌its区/真菌18s rdna区的双v区或多种单v区进行测序，使用低循环数扩增，保证每个样品扩增的循环数统一；采用特殊方法可有效避免系统内误差；数据质量高，有效序列q30达到90%以上；加上最新升级的分析内容和解释详尽的结题报告，带您享受极致的微生物扩增子测序体验。