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发稿时间：2017-10-30来源：天昊生物

摘要： ssr与精细定位

ssr (simple sequence repeats，简单序列重复)是一种常用的遗传分子标记。之前小编给大家介绍了ssr在遗传多样性、群体结构和性状关联分析中的应用（）。除此之外，ssr还可以在基因的精细定位中发挥作用。

要做到“精细定位”，既需要该区间存在足够多的分子标记，又需要有足够多的重组事件发生，二者缺一不可。没有足够的分子标记，就无法进一步缩小区域范围；没有重组事件发生，则无法衡量分子标记与目标基因的距离。要获得高密度的标记，通常需要在基因组或者转录组测序获得序列信息后，利用相应生信工具进行标记开发；要增加重组事件发生，往往要靠扩大群体来实现。下面小编就以大豆花叶病毒（smv）抗性基因精细定位为例，跟大家分享两篇近期发表案例。

1、大豆花叶病毒新的抗性基因rsc15的精细定位及鉴定

 

发表时间：2017年8月  发表期刊：theor appl genet. 影响因子：4.132

研究背景：

大豆花叶病毒是一种严重危害大豆产量的病害，前期研究发现有些大豆品种具有很强的抗病表型，后发现多个抗病基因（rsv1,rsv3, rsv4,rsc3,rsc4,rsc7,rsc8, rsc14）。作者前期发现一个新的基因rsc15，本文在此基础上利用构建的ril群体对其进行精细定位。

样品选取：

抗病品种rn-9与易感品种7605杂交后的f1、f2 (315个单株)及ril群体（216 个f_7:11个株系植株）。

ssr标记的选择：

15个ssr标记用于初定位结果的验证 (satt640, satt227,sat_153, satt322, sat_213, sat_246, satt286, satt277,satt557, satt658, satt100, satt708, sat_238, staga001, satt433)，132 ssr标记用于精细定位（108个区域ssr标记用ssrhunter软件新开发的24个ssr标记）。

表型鉴定：

表1、不同群体材料抗病性表型鉴定

 

表1结果表明，f2群体抗病和不抗病植株为3:1，rils群体抗病和不抗病植株为1:1，经过卡方检验，与孟德尔分离比率一致，表明该性状主要有一个主效基因控制。

利用ril群体进行精细定位：

 

图1、遗传连锁图谱

前期研究，将rsc15初步定位在6号染色体sat_213和satt286之间的14.6 cm (~1.6 mb) 区域（图1）。通过在父母本植株中对132个ssr多态性检测，发现18个ssr具有多态性，用于216个ril群体株系基因型检测，最终利用join map 4.0及mapchart 2.2软件构建遗传图谱，根据最小对数似然比lod为3建立连锁群，最终把rsc15定位在了ssr_06_17和 barcsoyssr_06_0835之间（图1）。

 

图2、smv抗性基因（rsc15）的遗传和物理图谱

通过分析标记在大豆williams 82参考序列 (glyma wm82.a2.v1)中的位置，确定了rsc15位于95kb的一段区域内（图2-c），包含5个预测基因，通过测序发现只有 gmpex14(glyma.06g182600)具有多态性，除此之外，侧翼区域的glyma.06g175100, glyma.06g183500 和glyma.06g184400也具有多态性，也归为潜在的候选基因（图2-d, 表2）。

表2、候选基因列表

 

后面通过在不同组织及不同病毒处理时间下候选基因表达检测，以及对抗逆相关的h₂o₂浓度、cat和pod活性检测，最终发现它们之间存在着高度的相关性（图3）。

图3、rn-9中gmpex14表达水平与h₂o₂浓度、cat和pod活性的相关性分析

文章总结：

整篇文章从新ssr分子标记的开发、扩大的ril群体构建，到从抗病表型和基因型检测，再到精细定位后候选基因表达及后续功能分析一气呵成，还是比较完整的一篇文章。美中不足就是在功能方面，如果能将抗病品种rn-9中的gmpex14转到易感品种7605中，并分析其抗病能力的话，文章将更上一个台阶。

2、具有smv抗性的大豆品种suweon97相关基因rsv1-h的精细定位

 

发表时间：2016年8月  发表期刊：theor appl genet. 影响因子：4.132

样品选取：

对sc6-n 和sc7-n具有抗性的抗病品种suweon 97与易感品种williams 82，及其杂交后的f1、f2 (267个温室种植单株及1150个大田种植单株)、f_2:3（73个单株）和f_3:4（13个株系）群体。

 

图4、精细定位流程图

ssr标记的选择：

在13号染色体的之前定位的rsv1区域发现有128个ssr标记，22个在父母本中显示出多态性。

表型鉴定：

表3、f2群体抗病性表型鉴定

 

表3结果表明，f2群体抗病和不抗病植株为3:1经过卡方检验，与孟德尔分离比率一致，表明该性状主要有一个主效基因控制。

 

为了验证是否真正连锁，选用13_1103和13_1187两个标记对1,150 f2单株进行群体基因型检测，在suweon 97和williams 82中具有相同基因型的分别记为1103^ss1187^ss和1103^ww1187^ww，最终分别得到262株和285株。自交后得到f3代，随机选取100粒种子种植后进行抗病表型检测，最终验证了之前的连锁结果（图4）。

 

图5、重组f2代单株基因型物理图谱及对应f_2:3植株抗病表型

此外，还检测到529株f2^1103sw1187sw杂合植株，另外74株在13_1103和13_1187两个标记之间发生重组（1103^ss1187^ww或1103^ww1187^ss），然后利用剩余20个ssr对这74个重组植株进行基因型检测，进一步寻找重组交叉点，最终将rsv1-h定位在suweon 97品种的13_1114和13_1115附近区域（图5）。

 

 

图6、13个重组f_3:4株系基因型物理图谱及对应抗病表型

种植13个f_2:3株系，选取在重组位点左右两段均为纯和且分别来自父母本的f_3:4进行表型鉴定，进一步验证了rsv1-h在suweon 97品种的13_1114和13_1115附近区域（图6）。

表4、候选基因列表

最后，本研究根据定位到的~97.5kb区域进行基因组分析，寻找到8个可能的候选基因，其中2个可能与抗病有关。文章并未对基因的功能进行深入探讨。

 

通过对以上两篇文章的解析可以发现，利用ssr分子标记进行基因精细定位的思路十分清晰：构建群体，筛选有多态性的ssr，基因型及表型分析，遗传及物理图谱定位，根据基因组信息列出候选基因，进行表达量等功能分析。思路流程理清了马上开始着手实验，一篇4分多的文章就在不远的前方！

 

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