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发稿时间:2017-08-24来源:天昊生物

摘要: rna-seq方法大整合

rna-seq是转录组研究的一项重要技术方法,自从它诞生以来,已经发展了上百种分析工具。人们往往更加热衷于对新的分析工具的开发,而忽视了对已有工具的系统性整合。近期在nc上发表了一篇通过对rna-seq广谱性分析文章,获得对转录组数据更加全面的认识。

 

期刊名:nature communications      发表时间: 2017年7月    影响因子 12.124

 

rna-seq技术的广泛应用为转录组研究迎来了一个新时代。根据研究内容的方向,精度、速度和成本要求不同,科研人员需要对包括采取何种具体测序方法流程、样品类型、所需的分析结果,以及基因组研究现状和计算数据处理可用资源等内容进行权衡。因为涉及的问题复杂多样,如何找到一种最佳的工作流程,在成本和性能要求基础上,通过对rna-seq分析中涉及到的各个不同环节进行最优选择,便成为是至关重要的问题。

 

为了解决上述问题,研究者提出了一个综合性rna-seq方案  rna-cocktail法,这种方法分析了一系列rna-seq工作流程,除了分析rna表达情况之外,研究者还对rna变异识别、rna编辑和融合检测方法进行了评估。他们利用39个分析工具,对生殖系、癌症和干细胞的15个样本数据集进行了120个组合的490项分析,实现了工作流程的更高精度化,提供了更多生物学相关预测。流程代码下载网址:http://bioinform.github.io/rnacocktail/

 

rna-seq数据集来源:

rna-seq分析设计方案:

图1、rna-cocktail分析设计方案

 

用于比较的分析软件列表:

基于有参序列的转录本鉴定:

图2、不同序列比对策略性能比较

研究者比较了tophatstar14 hisat2三种最常用的拼接软件,最终从整体的比较结果看,hisat2star14tophat分别快了大约2.5倍和100倍(图2)。

之后,研究者又比较了cufflinks和stringtie这两个常用的基于比对的转录组工具,结果发现虽然cufflinks在基因层面的检测要比stringtie灵敏一些,但是stringtiecufflinks多预测50–200% 的转录本,并且比cufflinks分析速度快约60倍。

de novo 转录本组装:

当缺少参考基因组或者转录组数据时,测序reads的de novo组装可以被用来构建转录本。本研究分析了三种广泛应用的工具:trinityoasessoapdenovo-trans。对rna-seq数据的分析结果发现,oases在所有样本中,具有最高的n10到n50值,表明它具有发现长转录本的优势(图3)。在对exn50的测试中,oases同样具有更有效的捕捉低表达基因的能力。而考虑到较低内存配置及计算需求时,soapdenovo-trans则是最为高效的方法。

图3、不同de novo转录本组装技术性能比较

差异表达分析:

rna-seq的一个重要目标就是鉴定不同样本和条件下基因表达差异情况,人们开发出多种检测方法,比如deseq2、limma、edger、cuffdiff、ballgown和sleuth等。这些工具用于检测seqc样品中的1001个表达差异基因的性能差异,结果表明,deseq2较为明显的优于其他方法(图4)。

4、不同基因表达差异工具性能比较

rna-seq变异分析:

除了检测差异表达信息之外,rna-seq数据还可以用于鉴定基因组和转录组重要的变异情况。

5、不同变异识别(a-c)、rna编辑(d-e)和rna融合(f)检测方法比较

在变异识别中,常用到samtools mpileup和gatks haplotypecaller工具。通过与其他环节多种工具的组合对比发现,samtools和gatk具有较为类似的处理时间和性能。rna编辑作为转录后调控的重要过程,可以影响序列功能及表达水平,本研究重点对giremi工具进行了分析。rna-seq的另外一个重要应用就是对融合基因的检测,比较常用工具jaffa、 star-fusion、tophat-fusion、fusioncatcher和soapfuse,以及长片段工具idp-fusion和iso-seq的结果发现,fusioncatcher和idp fusion表现出更高的灵敏性和准确性(图5)。

 

高准确性工作流程rna-cocktail流程:

图6、rna-cocktail流程图

综合上述工具比较分析结果,研究者对各个环节表现更好的工具进行整合,提出了rna-seq分析高准确性工作流程—rna-cocktail(图6)在数据验证后发现,该流程优于之前的其他工作流程,如galaxygrape等方法。

 

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