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发稿时间：2017-05-25来源：天昊生物

 南京农业大学陈巍教授课题组近期在《plant soil》上发表了富含木霉的有机肥可以减轻单作土壤微生物恶化从而更好地维持植物生长的文章。在恭喜天昊生物客户又发表微生物文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：trichoderma-enriched organic fertilizer can mitigate microbiome degeneration of monocropped soil to maintain better plant growth

中文题目：富含木霉的有机肥可以减轻单作土壤的微生物恶化从而更好地维持植物生长

期刊名：plant soil      发表时间： 2017年    影响因子： 3.11

研究目的: 研究不同施肥制度驱动下土壤微生物的转变将有助于减轻农业系统中单一栽培的负面影响。

材料方法:

富含木霉有机肥准备及盆栽试验描述

把（猪粪：菜籽粕=1:1, w/w）和哈茨木霉sqr-t037孢子悬浮液按比例(100:1, w/v)制成混合有机肥，然后有氧发酵7天。为了调查三种不同施肥方式对单作系统土壤微生物的影响，在温室中通过重复施肥连续进行5次番茄盆栽实验。三种不同施肥方式分别是：1）cf：100%化肥；2）bf：75%化肥富含木霉有机肥；3）：of: 75%化肥混合有机肥（不含木霉）。每种施肥方式使用6盆，每盆有2株番茄。

根际土壤采样与dna提取

番茄连续种植第五个生长季后，从每个盆里收集土壤样品。使用powersoil dna isolation kit (mobio)提取18份土壤样品中的总dna。测定土壤化学性质，包括土壤有机质（om），可用氮、可用磷、可用钾、总氮、总磷、总钾。

real-time pcr检测土壤细菌和真菌含量

使用real-time pcr量化土壤细菌和真菌数量，细菌引物：338f (5′-actcctacgggaggcagcag-3′) 和518r (5′-attaccgcggctgctgg-3′)。真菌引物：its1 (5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′) 和 5.8s (5′-cgctgcgttcttcatcg-3′)。将16s和its片段克隆到pmd 19-t载体，然后此重组载体作为标准质粒。

miseq测序

细菌测序区段为：（v3，v4）；真菌测序区段为：（its2）。

三种施肥制度下的植物生长测定

为了分析三种施肥制度对下一茬作物生长的影响，在温室下进行了另外的盆栽试验。番茄单一轮作5次后，每个盆收集300g土壤，然后转移到一个新的含有21天大小番茄的盆中，生长4周后，使用minolta spad-502测定最新生长的两片完整叶的叶绿素。同时测定幼苗的生物量和根系生长状况。

研究结果：

土壤养分特性

三种不同施肥制度连续处理五次后，土壤营养特性差异巨大，所有测试的土壤营养成分，包括有机质（om）、铵态氮、可用磷、可用钾、总氮、总磷、总钾在bf和of组相对于cf组（全化肥）是明显增高的，除了硝态氮。同时，相对于of组（普通有机肥），从bf组收集的土壤有显著较高的有机质（om），速效磷，速效钾，总氮。

表1 不同施肥制度对土壤特性的影响

细菌和真菌种群

qpcr检测结果（图1）表明，bf处理的土壤具有最多的细菌种群，其次是of处理过的土壤， cf处理的土壤细菌种群数量最少。然而，三种不同施肥处理土壤的真菌种群之间则没有明显的差异。

        

图1  real-time pcr检测土壤细菌和真菌含量

细菌和真菌α多样

所有样品的coverage指数为0.99，表明测序能力足够，能捕捉每个土壤样品的完整多样性（表2）。指数chao1表明bf处理土壤细菌和真菌群落otu个数比cf组和of组多。此外，bf处理土壤具有最高的细菌shannon指数，cf 处理组和of 处理组分别具有最低的细菌shannon指数和真菌shannon指数。

表2 不同土壤样品的丰富度、多样性和盖度度统计

土壤细菌和真菌群落组成

每个土壤样本平均得到89494条序列，如图2所示，虽然不同土壤样品细菌和真菌群落门水平组成相似，但是三种不同施肥处理土壤门水平分布是有差异的。所有样品优势细菌门是放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门（图2a），优势真菌门则是子囊菌门和担子菌门（图2b）。放线菌门占cf组细菌群落的53%，但是在bf和 of组分别占39%和42%。相反的是，厚壁菌门在bf组、of组、cf组分别占10%、10%、5%。变形菌门在bf组和of组相对于cf组更丰富。至于真菌群落，在cf处理组中，球囊菌门和接合菌门的丰度要比bf 组和of组高，而相对于其它两组，bf组则有丰度最高的壶菌门。

图2 所有土壤样品主要细菌门（a）和真菌门（b）的相对丰度（%）。

植物生长测定

通过测量叶绿素含量、株高、干重和根系（表3；图s3）来评定三种类型单作土壤对植物生长的影响。生长在bf处理的土壤上的番茄幼苗有最高的株高、生物量和叶绿素含量，其次是生长在of处理土壤上的番茄幼苗。与此相反，cf处理组的幼苗有着显著降低的高度、生物量和叶绿素含量（与bf组相比，分别下降了75%，54%和89%）。相对于cf组， bf和of组的番茄幼苗根部发育更加良好，例如总根长、表面积和平均直径。此外，bf处理组的根表面积和平均直径比of组显著较高。

表3 三种不同处理土壤番茄幼苗生长及根系发育测定

土壤微生物、土壤化学性质和植物生长之间的关系

基于微生物门水平、土壤化学性质和植物生物量数据的rda分析结果表明， 第一成分（rda1）可以把cf组和其它两组（bf和of）分开，而第二成分（rda2）则不能区分开这三组。如rda分析（图3）和spearman’s相关性结果（表4）所示，酸杆菌门、厚壁菌门和变形菌门与大部分的土壤营养特性正相关，同时与土壤硝态氮呈负相关。相反的是，放线菌门和接合菌门与土壤硝态氮正相关，而与速效钾、总磷、总钾呈负相关。土壤总磷与芽单胞菌门正相关，与球囊菌门和接合菌门呈负相关。壶菌门和土壤有机质（om），总氮呈正相关。另外，bf组较高的植物生长率与酸杆菌和变形杆菌的丰度呈正相关，大部分土壤性质除硝态氮之外，与放线菌呈负相关。

       

图3微生物群落、环境变量和植物生物量之间的rda分析

表4 植物营养成分与纲水平不同微生物之间的spearman’s相关性分析

总结：

l  cf（100%化肥）处理组土壤导致细菌多样性最低，而bf（75%化肥富含木霉有机肥）处理组土壤的细菌多样性水平最高。

l  of 处理组土壤的真菌多样性水平最低，而cf和bf处理组土壤的真菌多样性水平较高。

l  bf处理组土壤的肥力和植物生长状况最好，of和cf处理组紧随其后。

l  与cf 和 of处理土壤相比，富含木霉有机肥的bf处理是控制单作土壤微生物恶化从而保持番茄植株健康生长的最佳制度。

关于天昊：

      天昊生物采用miseq pe250测序策略对细菌16s rdna区/真菌its区/真菌18s rdna区的双v区或多种单v区进行测序，使用低循环数扩增，保证每个样品扩增的循环数统一；采用特殊方法可有效避免系统内误差；数据质量高，有效序列q30达到80%以上；加上最新升级的分析内容和解释详尽的结题报告，带您享受极致的微生物扩增子测序体验。