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发稿时间：2016-12-12来源：天昊生物

      南京农业大学资源与环境科学学院凌宁教授课题组近期在《frontiers in microbiology》上发表了施肥制度对丛枝菌根真菌（amf）群落组成的影响与玉米根际土壤中的有机质组成相关的文章。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的扩增子测序工作和生物信息学分析。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：impacts of fertilization regimes onarbuscularmycorrhizal fungal (amf)community composition werecorrelated with organic mattercomposition in maize rhizospheresoil

中文题目：施肥制度对丛枝菌根真菌（amf）群落组成的影响与玉米根际土壤中的有机质组成相关

期刊名：frontiers in microbiology发表时间： 2016年11月影响因子：4.165

技术：18s rrna扩增子测序，amv4.5nf–00引物

测序平台：illuminamiseq测序平台

实验描述

田间施肥试验于2013年在黑龙江省农科院的现代农业科技示范站实施。这个地区有典型的季风气候，年平均3.6^◦c和486.4–543.6毫米降雨量。种植制度主要是一年一次玉米作物。有四个实验处理：（1）nk，只施加氮和钾肥；（2）npk，只施加n、p、k肥；（3）npkm，施加n、p、k和有机肥；（4）m，只施加有机肥。每一个处理在不同的3个地块有三个生物学重复。

根际土壤采样与dna提取

于2014年10月从各处理收集根际土壤样品，从每一个地块随机收集五个玉米植株的根际土壤样品组成混合样品。根被大力地震动从而分离那些不是紧紧地吸附于根上的土壤，然后，5克含有牢牢吸附土壤的植物根际溶于30毫升蒸馏水，并高速涡旋1分钟。蒸馏水中的土壤作为根际土壤用于后续分析。真空冷冻干燥后，一部分被保存在4^◦c 用于gc–ms分析，而另一部分被存储在−80^◦c用于dna提取。每个肥料处理的3个生物学重复根际样品用于dna提取。使用powersoil dna isolation kit(mo bio)提取0.25克冻干土壤的总dna。

根际土壤溶解有机物提取和gc–ms分析

乙酸乙酯提取的溶解有机物（dom）用于gc–ms分析。由于土壤溶解有机物dom的高多样性，乙酸乙酯提取的溶解有机物（dom）不包含所有复杂的土壤有机质，但它能全面阐述溶解有机物（dom）中的所有可能的分子类别。每个土壤样品（0.5克）和5毫升乙酸乙酯添加到离心管。30◦c 170转摇1小时，该悬浮液被过滤（0.45毫米）到一个干净的离心管，35◦c真空浓缩至0.5毫升，浓缩样品被存储用于gc–ms分析。

研究背景:肥料应用的增加提出了一个问题：富营养化的土壤对土壤微生物群落产生什么影响。一些研究表明，平衡施肥，包括补充氮（n），磷（p）和钾（k），改变了土壤微生物群落和增强了土壤微生物的有效代谢因为可利用营养的增加，在多数情况下，这会导致土壤生产力的提高，但是过量和不适当的化肥施用会造成了一系列环境问题和土壤退化。与化学施肥相比，对农业生态系统施加有机肥料常被用来增加土壤有机质（som）的含量，用来改变了土壤物理、化学和生物性质，因此提高了作物产量。微生物是土壤生态系统的重要组成部分，因非常有必要了解有机或无机肥施用对土壤微生物群落的影响。例如，土壤真菌多样性被认为是一个很好的和灵敏的土壤肥力指标。丛枝菌根真菌（amf）是一类重要的土壤微生物群，它能调节农业生态系统中的多种功能。

丛枝菌根真菌是古老的根共生生物，它们的第一次出现与陆生植物的出现相吻合。丛枝菌根真菌（amf）与80%的陆生植物物种的根形成共生体系，丛枝菌根真菌从植物体内获取必要的碳水化合物及其他营养物质，而植物也从真菌那里得到所需的营养及水分等，因此amf在农业生态系统中发挥着关键作用，土壤对某些营养素的需求可通过amf群落组成或多样性的变化反映出来，然而，人类活动如何驱动amf群落变化仍然是未知的。所有amf都属于球囊菌门，而且大多数是专性共生，是不能单独培养的。因此amf类群的鉴定不能依赖传统的培养方法。在这项研究中，我们使用扩增子测序调查不同施肥制度对玉米根际土壤amf群落组成和多样性的影响。

研究结果：

数据统计

通过对数据进行处理和优化，得到1214071条有效序列，占主导地位的长度分布为大约221-240 bp。通过和silva数据库比对，得到了很多非球囊菌门得序列，总体而言，使用引物对amv4.5nf/amdgr只得到了165805条球囊菌门序列（占总数的13.5%），其它主要真菌类别是壶菌门、basidiomycota,、zygomycota,、ascomycota、blastocladiomycota（表1）。

表1 使用引物对amv4.5nf/amdgr只得到土壤样品中的每个真菌门序列的比例分布

施肥对amf群落a多样性的影响

与其它处理相比，施加有机肥（m）能显著增加amf群落otus的数量（图s1）。计算了每个样本的shannon 指数和ace指数（图1）。施加有机肥（m）土壤中的ace指数显著较高。

图s1  样品的稀释性曲线

图1 不同处理样品的shannon 指数和ace指数

施肥对amf群落组成的影响

在不同处理中，amf群落组成变化很明显。第一主成分能解释amf群落变化的62.22%，能把是否施加有机肥的群落明显分开（图2）。adonis分析结果表明，不施加有机肥（−m）的组别，包括nk和npk，与有机肥处理（ m）组别，包括npkm和m，在群落水平上有显著差异(r²=0.41559, p = 0.003)（表s1），因此，我们把4个处理分为两组（−m和 m）用于随后的分析。

图2 不同处理amf菌落的rda分析

表s1不施加有机肥（−m）与施加有机肥（ m）组别的amf菌落结构差异

同时，施用有机肥是带来玉米根际amf群落组成变化的第一关键因素（r²= 0.7695，p= 0.002）（表s2），第二大影响因素是n肥（r²=0.6472、d p 0.022），其次是磷肥（r²=0.5048，p =0.04）。

表s2amf菌落结构rda的蒙特卡洛置换检验

乙酸乙酯提取的溶解有机物（dom）和amf群落组成之间的关系

mantel检验发现根际土壤的乙酸乙酯提取溶解有机物与amf群落显著相关。gc–ms共鉴定了59个有机化合物，其中11个有机化合物被确定与amf群落相关，11个相关分子中大部分是长链烷烃和苯。同时硬脂酸和3-(2, 6, 6-trimethyl-1-cyclohexene-1-yl) allylalcohol在npkm处理土壤中没有被检测到，而1、4-dimethylnaphthalene只是在nk处理土壤中被检测到，然而，2-ethylnaphthalene在nk处理土壤中没有被检测到。此外，十八烷和二十六烷在有机肥处理组别(m、npkm) 都没有检测到，但是在无机肥处理组别 (nk、npk)（m、npkm）都检测到了，这表明不同类别肥料处理通过改变有机成分推动了amf群落的变化。

乙酸乙酯提取溶解有机物与amf群落属的皮尔森相关性分析表明两类有机化合物与 球囊霉属负相关，而一类有机化合物与rhizophagus正相关（图4）。

图4 乙酸乙酯提取溶解有机物与amf群落属的皮尔森相关性分析

有机肥料处理和无机肥料处理的amf群落网络图差异

基于上述结果，我们把4个土壤处理划分为两个处理( m和-m)。因此，我们用这两个处理用于网络分析。如图5所示，有机肥料处理(npkm、m)和无机肥料处理(nk、npk)的网络分析结果是有显著差异的。在无机肥料处理 (−m)中，网络有36个节点和80个边缘，4个群落的模块化为0.540。在有机肥料处理 ( m)中，网络有35个节点和86个边缘，5个群落的模块化为0.438（图5）。我们定义有七个以上边缘的节点为网络中心，有机肥料处理 ( m)网络中心的数量多于无机肥料处理 (−m)，这表明有机肥料处理 ( m)有更多活跃的物种在amf群落中与其他物种存在相互作用。所有的网络中心都被归类为球囊霉目。同时，两个网络共享3个网络中心，包括otu9，otu31和otu217。这个三类otus属于进化树的不同分支（图6），otu9和otu 217属于球囊霉属，而otu31属于近明球囊霉。

图5无机肥料处理 (−m)和有机肥料处理 ( m)amf群落的网络图分析

图6 两个网络图分析得到的所有otus序列的进化树分析

总结：

•  在玉米根际amf真菌多样性被不同施肥制度显著改变。

•  施用有机肥是带来玉米根际amf群落组成变化的第一关键因素，第二大影响因素是n肥，其次是磷肥。

•  gc–ms测定发现施加有机肥能显著改变玉米根际的有机质组成，皮尔森相关性分析表明两类有机化合物与球囊霉属负相关，而一类有机化合物与rhizophagus正相关。

•  有机肥料处理和无机肥料处理的amf群落网络分析结果是有显著差异的，有机肥料处理网络中心的数量多于无机肥料处理。两个网络共享3个网络中心，这三类otus都被归类为球囊霉目。

•  综上所述，不同施肥模式对amf群落的影响于玉米根际土壤中有机质组成相关，而施用有机肥能激活更多的amf物种与其他玉米根际的物种相互作用。这为调节植物和真菌的共生系统，维护作物的高产量和健康生长，并为合理施肥提供了初步依据。

关于天昊：

      天昊生物采用miseq pe250测序策略对细菌16s rdna区/真菌its区/真菌18s rdna区的双v区或多种单v区进行测序，使用低循环数扩增，保证每个样品扩增的循环数统一；采用特殊方法可有效避免系统内误差；数据质量高，有效序列q30达到80%以上；加上最新升级的分析内容和解释详尽的结题报告，带您享受极致的微生物扩增子测序体验。