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发稿时间：2016-11-15来源：天昊诊断

下面小编带大家回顾这篇研究，一起探讨究竟哪个是用于临床sma诊断的最优方案。

南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室副教授- 李亮在“中华医学会第十五次全国医学遗传学学术会议”做相关介绍

  英文题目

evaluation and comparison of three assays for molecular detection of spinal muscular atrophy

  中文题目

三种用于脊髓性肌萎缩症的分子诊断方法的评价和比较

  期刊名

clin chem lab med  if: 3.009

  发表时间

2016.10

  单位

南方医科大学基础医学院

  方法

qpcr,mlpa, cnvplex
1.smn1，smn2和naip基因的拷贝数通过qpcr，cnvplex®技术进行检测。
2.通过与mlpa的比对，对上述两种方法的重复性和特异性进行验证。

  探针分布

多重q-pcr方法（figure 1 a）共设计4对探针，分别是用来扩增smn1的第7号外显子（141bp），smn2的第7号外显子（71bp），naip的第5号外显子（123bp）以及reference序列 。

mlpa（figure 1b）试剂盒共设计37对探针，其中15对位于sma相关基因上，22对位于对照区域。

cnvplex^®（figure 1c）试剂盒共设计74对探针，其中41对为sma相关基因特异性探针，33对位于不同染色体的对照区域。其中41对特异性探针中，26对位于smn1和smn2的第1，2a，2b，3,4,5,6,7,8外显子，4对特异性的位于smn1和smn2的7,8号外显子，5对设计于naip的第5.6号外显子，还有5对位于sma相关基因的flanking区域。

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，sma)主要由于sma相关基因的缺失导致的，此研究的目的是通过sma相关基因剂量实验对sma做出分子学诊断，并评估三种方法的可行性与优势所在。

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，sma)是较常见的常染色体隐性遗传病，也是一组儿童期仅次于dmd，居第二位的常见神经肌肉病，发生率约为1/6000~1/10000活产儿，人群携带率为1/40~1/50。主要表现为进行性、对称性四肢和躯干肌肉无力、萎缩，重症患儿常死于呼吸衰竭。根据发病年龄和进程，sma可分为四型：婴儿型（sma i型）,中间型 （sma ii型）,少年型（sma iii型）,和成年型(sma iv型)。

sma的致病基因为位于5q13.2的运动神经存活基因(smn)和神经元凋亡抑制蛋白基因(naip)。其中smn基因在人类基因组中是两个高度同源的基因，即smn1和smn2，这两个基因串联排列在染色体上，只有5个核苷酸位点的差异。smn1是主要的功能基因，smn2在同一个染色体上可有多份拷贝。约94%的sma患者是smn1基因7外显子拷贝的缺失导致，smn2基因c804 c>t的碱基变异破坏了smn2基因外显子剪接增强子结构，导致约90%的smn2 pre-mrna外显子7被错误剪接掉，最终编码出不稳定、易被降解的截短蛋白(smnδ7)，约10%smn2可以表达少量全长有功能的smn蛋白，因而smn2基因拷贝数与sma的疾病严重程度呈负相关：smn2基因拷贝数在sma i型患儿中多为2拷贝，在sma ii、iii型患儿中多为3~4拷贝，sma iv型患儿中多大于4拷贝。神经元凋亡抑制蛋白基因(naip)也位于5q13.2，naip的缺失主要在sma i型中被发现，尽管nai     p导致sma机制不是很清楚，研究发现naip的5,6外显子缺失可能与sma表型有关。naip也有两个倒位重复基因，其中一个可产生有功能的基因（figure 2）。

figure 2.选自<临床遗传咨询>

sma不同基因型的组合：多数sma i型病人的基因型多为b-1或b-2所示的缺失纯合子，sma ii型,iii型的基因型为b-3或b-4的纯合子或双重杂合子，无症状sma携带者只有一个smn1拷贝，同时带有0-4个smn2拷贝。

拷贝数定量

多重q--pcr,mlpa,cnvplex^®三种方法目的区域（sma相关基因）的拷贝数（0，1，2，3）由不同的比值决定（figure 3）。

多重q-pcr是 2 − δδcq 值决定基因拷贝数： 2^− δδcq < 0.30 for 0 copies, 0.40~0.70 for one copy, 0.75~1.30 for two copies, 1.35~2.0 for three copies, and > 2.0 for four copies。

cnvplex^®的拷贝数与结果比值范围： ratio < 0.10 for 0 copies, 0.20~0.70 for one copy, 0.75~1.30 for two copies, 1.35~1.80 for three copies, and > 1.80 for four copies.  similar to mlpa assays。

结果超出以上范围的样本需重新检测。

重复性分析

    30个样本smn2基因的拷贝数检测用来评估三种方法的重复性，结果表明：

1.同一种检测方法不同次数之间并没有显著性的差异（table 2）；--重复性好

2.不同检测方法之间的结果存在显著性差异（p<0.05）（table 3）；

3.在检测smn2拷贝数的结果比值中，cnvplex^®的结果明显更接近理论值；

4.在检测smn2基因1拷贝的实验中，cnvplex^®的结果比值明显小于q-pcr((0.49 ± 0.06 vs. 0.62 ± 0.04, p = 9.46 × 10⁻⁹)和mlpa（(0.49 ± 0.06 vs.0.60± 0.06,p =2.8 × 10⁻⁷），而在q-pcr和mlpa方法之间没有发现显著性差异。检测 smn2基因2拷贝时, mlpa 的结果比值明显高 cnvplex^®(1.08 ± 0.07 vs. 1.03 ± 0.05, p = 0.007)或qpcr assays (1.08 ± 0.07 vs. 1.03 ± 0.04, p = 0.011)，而在q-pcr和cnvplex^®方法之间没有发现显著性差异。检测 smn2基因3拷贝的实验中，mlpa结果比值明显低于cnvplex^® (1.42 ± 0.08 vs. 1.50 ± 0.09, p = 0.007)，其他无显著性差异。

特异性与灵敏度分析

    为了测试q-pcr与cnvplex^®方法的特异性和灵敏度，研究者对应用于317个临床样本的2种方法的结果与mlpa的结果进行了比对，smn1，smn2和naip基因的结果均没有超出阈值范围的（figure 4），且基因剂量的结果（table 4）展现了100%的诊断准确率。

两种方法的准确率均达到的100%，相比较而言，qpcr的可重复性高（组内cvs：3.01%~8.52% ，组间cvs：4.12%~6.24%），cnvplex^®的得到的结果更接近理论值（0.49~0.5 for one copy, 1.03~1.0 for two copies, and 1.50~1.50 for three copies）。

总的来说，多重q-pcr是一种简单，快速，高性价比的方法，适用于常规的sma诊断以及携带筛查，而cnvplex^®的灵敏度很高，检测值更接近理论值，还可用于诊断携带smas复杂基因结构的特殊病例。两种方法都是非常可靠的，并适用于sma临床诊断。

从花费和耗时角度来说，q-pcr是最经济的且耗时最短的方法，约花费0.8美元，需要2.5h。mlpa花费较高，约10.5美元，需要22h完成实验。所以说q-pcr是检测sma最快速，准确，最具性价比的方法。但q-pcr和mlpa方法的限制性就在于通量低，只能单次检测一到十几个目的区域的拷贝数检测。

而sma相关的基因都处在染色体不稳定区域，其他的变异以上的两种方法都不能检测到，如之前在sma病患中发现的smn1基因的1-6外显子的缺失杂合突变。cnvplex^®的体系包括41对特异性探针，覆盖smn1，smn2的所有外显子，及naip的第5.6号外显子，就可以检测到所有探针所在位置的拷贝数变化，这对诊断sma的稀缺病患的复杂结构变异是十分重要的。

通量高：可同时实现48-480个区段拷贝数快速检测，检测效率大大增加。
准确性高：基于高特异性的连接原理，检测区域连接产物采用通用引物扩增，扩增效率基本一致，平均检测cv<10%。
分辨率高：可对6拷贝以内的片段进行准确定量。
重复性高：检测稳定性高，节约样品复孔的检测费用。
快速高效：使用的探针短，可以直接合成，无需克隆制备，更快。

天昊诊断自创立之初坚持以技术创新作为公司发展核心动力，基于目前国际流行的基因检测平台开发了多项创新技术， 其中包括accucopy^®多重基因拷贝数检测技术，cnvplex^®高通量基因拷贝数检测技术，imldr^®多重snp及突变分析技术，snpscan^®高通量snp及突变分析技术，easytarget^®多重基因片段快速富集技术， snpseq^®超高通量snp及突变分析技术，cnvseq^®超高通量基因拷贝数检测技术等具有国际水平的专利技术，希望通过自主研发的创新技术促进国内基础医学遗传研究以及人类各种疑难疾病的致病机理的探索，同时利用这些技术开发适合临床应用的各类基因检测产品，服务于我国人民大众的健康事业，同时还致力于科研相关试剂的研制与开发工作。因此，公司始终将"创新基因科技，守护人类健康"作为公司长期发展的核心理念。

reference：li l, zhou w j, fang p, et al. evaluation and comparison of three assays for molecular detection of spinal muscular atrophy[j]. clinical chemistry and laboratory medicine (cclm), 2016.