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发稿时间：2016-09-06来源：天昊生物

英文题目：transmission and microevolution of usa300 mrsa in us households: evidence from whole-genome sequencing

中文题目：全基因组测序证实美国家族中usa300耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)菌株的传播和进化

期刊名： mbio     发表时间： 2015,3      if：6.975

单位: 美国芝加哥大学医学部感染性疾病与全球卫生部门 

技术： whole-genome sequencing

测序平台： illumina hiseq 2000

材料： 146个芝加哥和洛杉矶usa300mrsa分离株、35个圣地亚哥usa300mrsa分离株、277个纽约usa300mrsa分离株

分析方法： denovo组装/贝叶斯进化树/ ml系统发育树构建

研究背景: 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌usa300是美国重症监护患者发生迟发性院内获得性肺炎的一个重要原因，其作为一个有毒的，易于传播的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，是美国家族中和mrsa菌株相关的最主要类群，这些细菌极易引起皮肤感染，坏死性肺炎和心内膜炎等。研究者使用全基因组测序技术对来自于2008-2010年芝加哥和洛杉矶146个皮肤软组织感染病人中分离得到的usa300mrsa菌株进行数据分析，并与先前发表的usa300mrsa参考基因组（35个圣地亚哥 277个纽约）进行比较，结果显示了菌株snps位点及全基因组系统发育分析，从而了解了菌株的传播动力学，遗传相关性和usa300mrsa在家族内的微进化等，从而为限制社区中mrsa的传播提供了可行性策略。

研究结果：

家族中usa300 mrsa菌株持续性

146个洛杉矶和芝加哥usa300分离菌株中，每个菌株测序深度约~200×，隶属于st8序列类型。通过对所有菌株中均存在的2,203,292-bp的核心核苷酸序列进行贝叶斯分析预估出这些菌株共有祖先的年代。图1中，蓝色分支菌株来自于芝加哥，黑色分支菌株来自于洛杉矶，红色和绿色分支分别是usa300 的tch1516和fpr3757参考菌株。对氟喹诺酮敏感(携带grla84s和gyra80s)和耐氟喹诺酮（携带grla84y和gyra80l）的分支分别由纵轴的绿色和红色区分。箭头处表示具有grla84f和gyra80l基因型的单个菌株。研究者还发现usa300菌株最近的共有祖先的预估年代为1993年，而这也与mrsa菌株在美国社区疾病传播发生的年代相一致。此外，还发现抗氟喹诺酮药性出现在1995年。

图1  146株usa300菌株核心基因组的贝叶斯分析结果

usa300泛基因组的持续性改变

通过将146株usa300菌株序列草图和ncbi上49株金黄色葡萄球菌的基因组完成图中的泛基因组组成（ 3,455个核心基因和非核心基因）进行比较，基于基因家族存在和缺失的模式发现所有的usa300菌株都聚在相同的分支上（图2）。

图2  146株usa300菌株和46株金黄色葡萄球菌的基因存在和缺失热图。红色和蓝色分别代表基因簇的存在和不存在。

图3为芝加哥家族9033的usa300分离菌株的acme基因组缺失图，最外面两层表示usa300菌株tch1516的参考基因组（深蓝色）；蓝色区域表示芝加哥家族9033菌株基因组概况，每个圆圈表示一个菌株，蓝色区域最外层标志性感染菌株120381含有acme，而芝加哥家族9033的其余12个usa300分离菌株则丢失acme精氨酸代谢移动元件；usa300参考菌株fpr3757（桔色）则存在acme，这些结果说明在菌株上原来存在的基因岛发生了丢失（图3），可见家族中usa300菌株的基因组构型在进化过程中发生改变。

图3  blastmap显示芝加哥家族9033的usa300分离菌株发生了acme基因缺失

家族中usa300菌株的聚类

对家族中usa300所有菌株，基于1629个（约130mbp）核心蛋白质类群建树（图4），图4中每个圆圈代表了一个单独的基因型，每种颜色表示不同的家族类型。圆圈大小和具有此基因型菌株的数量成正比。家族中标号由ch（芝加哥）和la（洛杉矶）分别表示。图中星号所标志菌株表示受感染的菌株。根据有无gyla80y和gyra84l基因突变（耐氟喹诺酮）将所有的usa300菌株分为cladei和cladeii，可见菌株间明显区分为两个大支（clade i和clade ii）。21个家族中有18个家族各自聚为单源类群，揭示出每个家族中均由一个单独的usa300菌株进化而来。

图4 所有usa300菌株家族遗传相关性最小化生成树图（mst）

usa300菌株氟喹诺酮耐药性的进化

为了鉴别驱使菌株聚类的遗传变异性因素，研究者使用全基因组 weir and cockerham’s fst分析（图5），发现芝加哥和洛杉矶分离菌株中有8个snps位点具有显著性差异，三个非同义包括与耐氟喹诺酮相关的gyla80y和gyra84l突变以及与细胞壁中主要信号传导系统相关的whia d17e。

图5  146个usa300mrsa菌株1595个snp位点weir and cockerham’s fst分析

usa300菌株氟喹诺酮耐药性不受地理位置的约束

基于来自于圣地亚哥，洛杉矶，芝加哥和纽约的核心基因组序列（约2.1mbp）使用realphy软件建树。图6中对氟喹诺酮敏感的菌株由绿色分支表示，耐氟喹诺酮菌株由红色分支表示，5个耐氟喹诺酮菌株有不同的突变(grla 80f and gyra 84l)，用桔红色表示，3个菌株只有在grla基因上有突变(80f)，用紫色表示。两个非usa300菌株（newman和col）以及两个usa300参考菌株（tch1516和fpr3757）图中右侧由空心圆圈表示。来自于不同地区的菌株在图中右侧分别由不同颜色表示。结果显示根据有无gyla80y和gyra84l突变(耐氟喹诺酮)菌株们可分为两大分支。还发现耐氟喹诺酮的usa300菌株在圣地亚哥（28/35，占80%），洛杉矶（59/70，84.2%）和纽约（186/277，67.1%）广泛分布，比芝加哥地区（23/75，30.6%）相比均有显著性差异（p<0.0001），说明usa300菌株氟喹诺酮耐药性的发育进化不受地理位置的约束。

图 6  460个us300菌株（458 2株非usa300菌株）的ml树图

研究结果：

●  与先前发表的usa300mrsa参考基因组（35个圣地亚哥 277个纽约）进行比较，发现来自于圣地亚哥(snp数目:17.6; 核苷酸多样性: л值3.1 *10 ^-5 )和芝加哥(snp数目:12; 核苷酸多样性: л值3.1 *10 ^-5 )的菌株遗传变异性很低。

●  一个家族内的菌株各自聚为关系较近的单源类群，并且一个家族内的菌株是由一个共同的祖先usa300菌株发育而来。
●  根据贝叶斯进化树家族推测usa300菌株最近的共有祖先的预估年代为1993年，而usa300菌株的抗氟喹诺酮药性出现在1995年。
●  usa300菌株氟喹诺酮耐药性不受地理位置的约束，并且耐氟喹诺酮的usa300菌株在于洛杉矶和纽约传播更广。