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发稿时间：2016-08-30来源：天昊生物

英文题目：in silico analyses of metagenomes from human atherosclerotic plaque samples

中文题目：人动脉粥样硬化斑块样本的宏基因组学分析

期刊名：microbiome     发表时间：2015        if：9 

技术：宏基因组测序

测序平台：illumina hiseq2000测序平台(pe100)

材料： （1）有症状的不稳定动脉粥样硬化斑块（case）：是从15例由于近期经受短暂脑缺血或轻微中风患者的颈动脉内膜切除术中获得的。（2）无症状的稳定动脉粥样硬化斑块（control）：是从7个患者的尸检中获得，这组患者的死因与心血管疾病无关。取3–5毫米厚的组织，立即储存于−80 °c。

研究背景:

动脉粥样硬化(atherosclerosis,as)是一组动脉硬化的血管病中常见的最重要的一种，其特点是受累动脉病变从内膜开始。一般先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，病变常累及弹性及大中等肌性动脉，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为动脉粥样硬化。不稳定动脉粥样硬化斑块是导致斑块破裂、溃疡致使动脉内血栓形成从而引起卒中的主要发病机制，具有极大的危害性。

通过观察和机理研究发现微生物感染能引起心血管疾病，血管壁的直接感染在动脉粥样硬化形成过程中发挥着关键作用，例如能够促进引起内皮功能障碍的炎症反应发生，并产生导致动脉粥样硬化和血栓形成的环境，最终导致心血管疾病，如急性心肌梗死或中风。现在已经有一些从动脉粥样硬化血管中分离出活性微生物的相关研究，然而目前关于动脉粥样硬化血管的微生物感染的高通量调查研究是非常有限的。

研究结果：

测序和数据处理

所有22个动脉斑块样品共产生2610268774条reads，然后把这些序列和人类hg19基因组比对，没有比对上hg19基因组的reads平均数是884727044（每个样本平均有33.89%，表1）。将这些non-hg19 reads与ncbi非冗余蛋白数据库比对，然后将pe reads输入到megan5软件。

表1：样本统计和序列比对

分类学注释

所有non-hg19注释 reads有2%-16%（平均4.6%）被分类为细菌，其余的是真核生物。表1展示了测序序列统计和不同阶段数据处理后的序列分配结果。图1描述了所有22个样品属水平的层次聚类结果。有趣的是，样品238和p0613是和其它样品最不同的，所有不稳定斑块样品（case组）聚集到一起，而所有稳定斑块样品（control组）也聚集到一起。相比于不稳定动脉粥样硬化斑块，稳定硬化斑块有更高的宿主微生物丰度，例如紫单胞菌科、链球菌科、拟杆菌科、微球菌科（图1）。相反的是，相对于稳定斑块样品，不稳定斑块样品有更多病原微生物，如螺旋杆菌科、奈瑟氏球菌科、硫消费家族如硫氧化共生体和硫发菌科（图1）。

图1：来自15例有症状动脉粥样硬化性患者（实验组）的不稳定动脉粥样硬化斑块和7例死于其它原因患者（对照组）的稳定斑块的分层聚类结果。

从序列统计（表1），多样性指数分析（表2），稀释性曲线（图2）明显可以看出22个样本中有2个样本(样本233 和 238)比其它样本有更多的物种数。

图2：22个样品（不稳定斑块样品和不稳定斑块样品）的物种稀释性曲线

表2：多样性指数分析

    另外pcoa分析和upgma树展现不稳定斑块样品和不稳定斑块样品分别聚类在一起（图3），只有3个样本(样本233, 238和p0613)是分离的，对于样本233, 238这可能是由于这两个样本有较多的物种数造成的，对于样本p0613这可能是由于这个样本的物种图谱与其它物种有明显不同造成的（图1）。

图3：22个样品（不稳定斑块样品和不稳定斑块样品）的pcoa分析图和upgma树。不稳定的动脉粥样硬化斑块样品用白色圆圈表示，7个稳定斑块样品（对照组）用灰色圆圈表示。

科水平下的分类学系统组成树展示了不稳定斑块样品和不稳定斑块样品在不同分类上的相对丰度差异。

图4：所有样品（不稳定斑块样品和不稳定斑块样品）科水平下的分类学系统组成树。不稳定的动脉粥样硬化斑块样品用白色表示，7个稳定斑块样品（对照组）用灰色表示。一些可能是人类起源的物种被标记为黑色的十字架。

图5展示了所有样本中丰度最高的25个菌种，不稳定斑块样品（case组）中丰度最高的是鼠李糖乳杆菌mtcc 5462，多糖奈瑟球菌atcc 43768，幽门螺旋杆菌hp p-4，食酸菌属 cf316，并且这些菌的丰度在不稳定斑块样品和不稳定斑块样品中存在差异，提示这些菌可能参与促进无症状动脉粥样硬化斑块向有症状动脉粥样硬化斑块的转变。

图5：所有样本中丰度最高的25个菌种，不稳定的动脉粥样硬化斑块样品用白色表示，稳定斑块样品（对照组）用灰色表示。

功能分析和总生物群落的比较

使用seed和kegg分类对总生物群落进行功能分析，结果发现在基础代谢和疾病通路方面不稳定斑块样品和不稳定斑块样品之间存在明显差异（图6），并且都参与“碳水化合物”、“氨基酸”和“能量”等有关代谢。另外也与“心血管疾病“、“循环系统”、“免疫系统”、“细胞生长与死亡”与“传染病”等疾病相关通路。

图6：使用seed（a）和kegg（b）分类对总生物群落进行功能分析，不稳定的动脉粥样硬化斑块样品用白色表示，稳定斑块样品（对照组）用灰色表示。

为了确定斑块样品中细菌种类的生长生理学，从丰度最高的细菌种类中挑出两个菌种（嗜酸菌和幽门螺杆菌）使用fish方法（使用嗜酸菌和幽门螺杆菌的特异探针以及两个阴性探针tm7 ，paracoccus spp）分析它们在不同病人斑块样品中的分布。结果发现嗜酸菌和幽门螺杆菌在动脉粥样硬化组织中以不同形态形式聚类在一起(图7a, b)，相反使用阴性探针tm7 ，paracoccus spp在样品中没有检测到任何信号(图7c, d)。

图7：嗜酸菌和幽门螺杆菌在在几个不同患者动脉粥样硬化斑块标本中的fish 影像。（a）嗜酸菌特异探针检测结果；（b）幽门螺杆菌特异探针检测结果；（c）阴性对照探针tm7检测结果；（d）阴性对照探针paracoccus spp.检测结果

结果总结：

为了调查动脉粥样硬化组织样品内的微生物多样性，采用了高通量测序对有症状的不稳定动脉粥样硬化斑块（case）和无症状的稳定动脉粥样硬化斑块（control）进行微生物宏基因组分析。结果提示在动脉粥样硬化斑块中存在很多微生物，并观察到这些微生物在症状斑块和无症状斑块这两组患者之间具有明显差异，从而确定了促进无症状动脉粥样硬化斑块向有症状动脉粥样硬化斑块转变的重要细菌。另外功能注释表明基本代谢和疾病途径在这两组患者之间存在明显的差异。