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发稿时间：2016-08-16来源：天昊生物

英文题目：the microbiome and metabolites in fermented pu-erh tea as revealed by high throughput sequencing and quantitative multiplex metabolite analysis

中文题目：通过高通量测序和定量多重代谢产物分析发酵普洱茶微生物组及其代谢产物

期刊名：plos one      发表时间：2016.6        if：3.057

技术：真菌its1区扩增子测序和细菌16s v4区扩增子测序

测序平台：illumina miseq测序平台

材料： 7片野茶树新鲜叶片&31个普洱茶叶片样本（15个生茶&16个熟茶）

分析方法：

        •  its1扩增子测序使用unite数据库;

        •  16sv4扩增子测序使用greengenes数据库;

        •  qiime计算alpha多样性(observed richness, chao 1, shannon, simpson evenness);

        •  pcoa&nmds分析beta多样性;

        •  r中vegan软件包进行群落相似差异性分析（adonis&anosim）;

        •  venn图比较组间共有和特异otu类群;

        •  使用r中indicspecies软件包筛选组间代表性物种;

        •  mantel检验真菌和细菌群落组成的潜在相互关系;

研究背景:

  茶在中国是最受欢迎和流行的消费饮品之一。常常产自于两种不同类型的茶树上，野茶树和普洱茶树。根据不同的处理过程，茶至少分为6中类型：绿茶，黄茶，白茶，红茶和黑茶。它们当中黑茶是最特别地，由于黑茶发酵过程中微生物的变化，将持续数月或者许多年。普洱茶就是黑茶的一种，分为生茶和熟茶的两种叶片类型。一种是传统的生茶原始发酵方式得来称为生茶，一种是速度较快的热熟茶的发酵方式成为熟茶。虽然一些研究已经调查了不同发酵时间普洱茶的微生物多样性，但没有人研究过新鲜叶片，生茶以及熟茶叶片去微生物群落特征，及细菌群落和真菌群落组成以及与环境因子之间的关联性。研究者采集了中国云南的7片野茶树新鲜叶片和31个普洱茶叶片样本（15生茶和16熟茶），旨在解决以下问题：1.鉴别普洱茶中微生物多样性和组成；2.比较新鲜叶片，自然加工普洱茶以及熟茶普洱茶中的微生物群落结构; 3.找出影响普洱茶微生物群落的潜在因素; 4.鉴定出普洱茶中的微生物代谢产物。

研究结果：

微生物物种丰度和群落组成

通过真菌its1区和细菌16sv4区扩增子高通量测序，每个样本含有超过了42383条真菌its序列和29721条细菌序列。进一步去除singleton，chimera序列以及一些低丰度的otu序列，得到每个样本约39507-214960条真菌序列和66-305472条细菌序列。通过与其它样本比较，发现新鲜叶片和一些生茶茶叶样本中细菌序列数目过少是由于序列中叶绿体序列过多导致（图1），新鲜叶片中占86.23%（红色线条），生茶叶片中约占65.81%（蓝色线条），而熟茶叶片中仅有0.09%（橙色线条），这些序列在分析中会被去除。最后去除物种丰度低于0.005%的序列共得到了390个真菌otu（每个样本65-175个otu）和629个细菌otu（每个样本18-466个otu）。

图1：叶绿体序列在每个样本细菌序列中的比例。

图2显示大多数真菌物种隶属于子囊菌门（305个otu，91.67%），细菌物种隶属于放线菌门（172个otu，43.16%），厚壁菌门（220个otu，37.01%）和变形菌门（158个otu，13.89%）。

图2：分配到每个真菌/细菌门的相对比例。对真菌来说，无论是otus (a)还是序列(b)子囊菌门是最丰富的。对细菌来说，无论是otus (c)还是序列(d) 放线菌门，变形菌门和厚壁菌门是丰度最高的。

新鲜叶片，生茶和熟茶的普洱茶叶片中微生物群落比较

将三种不同类别的叶片序列通过venn图分析发现（图3.a&图3.b），真菌物种中仅1/4（107/390）序列，细菌物种中仅1/6（107/629）序列为三种不同类别叶片所共有，暗示三种不同类型叶片中微生物群落组成的差异显著性。从共有otu数目统计，发现新鲜叶片和普洱茶叶片（生茶和熟茶）共享54%（173/318）的真菌物种和22%（138/625）的细菌物种，表明新鲜叶片是普洱茶发酵过程中重要的微生物储备场所。此外，为筛选出每个样本类型中特异otu对微生物群落的影响，对三种叶片类型的前100个丰度最高的otu进行venn图分析（图3.c&图3.d），发现三种不同类型叶片中共有的真菌和细菌比例急剧上升。

图3：新鲜叶片（红色），生茶（蓝色）和熟茶（橙色）的普洱茶 venn图分析

将不同样本序列抽频到相同的序列深度进行alpha多样性预估（图4），发现新鲜叶片（红色）比生茶（蓝色）和熟茶（橙色）的普洱茶叶片有着更多的真菌物种和更少的细菌物种。

图4：新鲜叶片（红色），生茶（蓝色）和熟茶（橙色）细菌（a）和真菌（b）物种丰度的稀释性曲线分析

真菌中（图5.a-d），新鲜叶片和普洱茶叶片（生茶和熟茶）的alpha多样性指数（observed species、chao1、shannon、simpson-e）有着显著性差异，而生茶和熟茶的普洱茶叶片之间均无显著性差异。细菌中（图5.e-h），熟茶的普洱茶叶片中的丰富度比新鲜叶片和生茶的叶片显著性升高，而香农和辛普森指数未显著性升高。

图5：新鲜叶片（红色），生茶（蓝色）和熟茶（橙色）细菌和真菌的alpha多样性分析

使用pcoa（图6）和nmds（图7）分析了真菌和细菌群落beta多样性，结果均显示出一致性结果，即在新鲜叶片和普洱茶叶片（生茶和熟茶）之间细菌群落组成有显著性差异。有趣的是发现发酵时间最老的普洱茶叶片（a6）与熟茶的普洱茶叶片更具有群落相似性，尤其是在真菌群落结构中。且通过anosim和adonis分析对群落相似性进行检验（表1），结果显示三种不同叶片类型的微生物群落结构均有显著性差异。

 

图6：新鲜叶片（红色），生茶（蓝色）和熟茶（橙色）真菌 (a)和细菌 (b)的pcoa分析。蓝色箭头所指的是发酵时间最老的普洱茶叶片（a6，28年）。

图7：新鲜叶片（红色），生茶（蓝色）和熟茶（橙色）真菌 (a)和细菌 (b)的nmds分析。

表1：新鲜叶片，生茶和熟茶之间真菌和细菌的anosim和adonis分析。

      此外，通过r中indicspecies软件包在不同类型叶片中筛选出许多指示性物种（表2），发现熟茶的普洱茶叶片的指示物种为一些嗜热或者耐热真菌和细菌，两个指示性物种（曲霉菌和blastobotrys adeninivorans）在普洱茶叶片（生茶和熟茶）中被发现，它们可以作为普洱茶叶片中主要的两大指示性物种，而这个结果也被先前的可培养研究和不可培养研究结果所证实。

表2：在新鲜叶片，生茶和熟茶中检测到的真菌/细菌指示物。

外界因素对普洱茶叶片群落结构变异的影响

      研究者调查了4个外界因素对普洱茶叶片群落变异的影响，包括时间，产地，纯茶vs污染的茶叶，未压缩茶叶vs压缩茶叶等。为了研究叶片发酵时间对微生物群落变异的影响，研究者将生茶和熟茶的普洱茶叶片样本分成两组（幼叶片和老叶片），或者三组（幼嫩，半老和老叶片）。在上述几种外界因素中，只有叶片发酵时间显著影响着群落结构，通过anosim和adonis分析比较发现发酵时间仅仅对生茶造成显著性影响。熟茶和相对应时间生茶有着相似的微生物群落，且与那些发酵时间短的生茶叶片有着明显区别。

表3：anosim和adonis分析检测四个外界因素对生茶和熟茶真菌和细菌的群落结构变异的影响。

mantel检验真菌和细菌群落间的相关性。发现在生茶中真菌和细菌两种微生物群落间无相关性。而16个熟茶的真菌和细菌群落之间有显著性相关性（p=0.004），当去除有其它植物污染的7个熟茶茶叶样本时发现熟茶的茶叶真菌和细菌群落之间也无显著相关性。

表4. mantel检验生茶和熟茶的真菌和细菌群落间的相关性

普洱茶叶片中产毒真菌及其毒素

      存在于所有样本中的15个最高丰度真菌中有几个真菌是产毒真菌，例如尼日尔曲霉、局限曲霉、桔青霉。接着对所有的普洱茶叶片样本通过lc-ms/ms进行真菌毒素检测，共发现了25个化学物质，大多数化合物浓度都很低。其中5个在所有的叶片中被发现，包括: asperglaucide, brevinamide f, emodine, neoechinulin a, andusnic acid等，并且asperglaucide无论是在生茶还是熟茶的叶片中浓度都是最高的。

 

图8：生茶（蓝色）和熟茶中真菌毒素检测。

结果总结：

这是一篇比较典型利用miseq测序平台结合真菌its区与细菌16s区域对微生物多样性以及群落组成等展开研究，探究真菌群落与细菌群落之间的相关性。适合推荐给真菌与细菌群落多样性结合研究的客户。

1. 群落组成分析：在新鲜叶片和生茶或者熟茶发酵的普洱茶叶片之间细菌群落组成显示出显著性差异。   

2. alpha多样性分析：生茶或者熟茶发酵的普洱茶叶片真菌群落多样性降低，细菌群落多样性升高。

3. beta多样性分析：熟茶和相对应时间生茶的普洱茶叶片有着相似的微生物群落，且与那些发酵时间短的生茶叶片有着明显区别。

4. 外界因素：时间显著影响着生茶发酵的普洱茶叶片，而熟茶则显示出相反的趋势。

5. 其他分析（如毒素代谢产物检测）：对茶叶片样本通过lc-ms/ms进行真菌毒素检测，共发现了25个毒素代谢产物，其中asperglaucide酰胺类和棒曲霉素占据主导地位 。